消饮化瘀方调节P38MAPK表达治疗慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化

王铭 王秀萍 徐建虎

(宁夏医科大学中医学院,宁夏 银川 750004)

慢性心力衰竭(CHF)是指心脏收缩和舒张功能发生障碍,使体循环或肺循环瘀血,从而出现心动过速、呼吸困难、下肢水肿为主要表现的一组临床综合征〔1〕,是所有心脏疾病自然病程的最终归宿,具有难以治愈且不可逆的特点,成为严重危害患者健康的疑难病症。心肌弥漫性纤维化是CHF的常见病理学改变,是心室重构的主要原因〔2〕。心肌纤维化主要是由于细胞外基质(ECM)的过量形成和沉淀,从而产生了瘢痕组织,进而引起的心肌内部结构改变,导致心肌顺应性降低、心脏舒缩功能受损,长期的容积或压力过负荷最终可引起心力衰竭〔3〕。因此,改善心肌纤维化在防治CHF中起到极为重要的作用〔4,5〕。研究发现P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)可以抑制ECM中胶原沉积,在改善心肌纤维化中起着重要作用〔6〕。中医认为CHF早、中期应以瘀血立论,以扶正化瘀施治。课题组通过整理文献及实验研究均发现,单纯从瘀血立论并不完全符合早期CHF的病机,水饮病邪在其中发挥重要作用。前期研究结果表明,温阳消饮法可降低CHF大鼠血管紧张素(Ang)Ⅱ、肿瘤坏死因子(TNF)-α及白细胞介素(IL)-6,抑制炎症反应〔7〕;可升高CHF大鼠降钙素基因相关肽(CGRP),降低内皮素(ET),调节心脏舒缩功能〔8〕;可通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路抑制心肌细胞凋亡,防止心肌受损〔9〕,提示早期CHF“从饮论治”的科学性。同时选用血府逐瘀胶囊作为对照组药物,二组药物疗效相当,说明水饮和瘀血在CHF早期均发挥了重要致病作用。因此,在CHF早期单纯从瘀论治或从饮论治均是不全面的。所以本课题将“饮瘀致病”作为治疗的切入点,认为CHF早期应消饮化瘀,并通过消饮化瘀方干预CHF大鼠,揭示其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1动物 6～8周龄雄性SD大鼠,SPF级,体质量240～260 g,由宁夏医科大学动物中心提供〔许可证号:SCXK(京)2019-0008〕。

1.2药物及试剂 消饮化瘀方中药材均购自宁夏医科大学附属回医中医院门诊部,经宁夏医科大学药学院中药教研室检验合格;美托洛尔(阿斯利康药业有限公司,批号:H32025391);盐酸阿霉素(源叶生物公司,批号:S17092)。苏木素染液(北京百灵威科技有限公司);伊红染液(源叶生物,R20594);羟脯氨酸(Hyp)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)及Ⅲ型胶原(ColⅢ)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自上海信裕生物科技有限公司;P38MAPK抗体(BIOSS,BS0637R);β-actin抗体(Affinity,AF7018);山羊抗鼠的二抗(北京中杉,ZB2305ECL);电化学发光(ECL)试剂盒(中杉金桥公司,货号sc-2048);HiFiScriptT 快速去除基因组cDNA第一条链合成试剂盒(康为试剂,Cat# CW2582M);2*SYBR Mixture 荧光定量试剂盒(北京天根,Cat# FP-205-2)。

1.3实验仪器 切片机(上海徕卡仪器有限公司,RM2016);电泳仪(北京六一公司,DYCZ-24DN);扫描仪(EPSON 公司,V19);荧光定量PCR仪(美国Bio-RAD,CFX ConnectTM);核酸蛋白定量仪(美国丹诺尔,DS-11)。

1.4动物分组及造模方法 用计算机随机数字法将72只SD雄性大鼠分为空白组与A组,A组参考文献〔10〕采用腹腔注射2 mg/kg盐酸阿霉素复制CHF模型,每周2次,共12次。造模成功后将CHF大鼠随机分为模型组、消饮化瘀方高、中、低剂量(中药高、中、低)组、美托洛尔组,各12只。

1.5药物干预 根据《中国药典》药物制备的相关要求,将消饮化瘀方浓缩至含生药2 g/ml的药液,给药剂量按照成人与大鼠体表面积折算,分别给予消饮化瘀方高(28 g/kg)、中(14 g/kg)、低(7 g/kg)及美托洛尔(10 mg/kg)灌胃,空白组和模型组给予等量的生理盐水,每日1次,连续4 w。

1.6苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织形态学变化 取心肌组织放入4%多聚甲醛固定,经冲水、梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤后,制成切片,烘片60 ℃ 2 h后进行脱蜡、梯度酒精脱水、苏木素染色、盐酸酒精分化、伊红染色、透明、封片。显微镜下观察心肌组织形态学变化并拍照。

1.7ELISA检测心肌组织中Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量 用组织匀浆机将心肌组织匀浆,取上清。按照ELISA试剂盒说明书分别设定标准品孔,空白孔及待测样品孔。标准品孔加入不同梯度的标准品,待测样品孔按照分组依次加入上清液及样品稀释液,空白孔不加。37 ℃孵育30 min;洗涤5次。除空白孔外,其余孔均加酶标试剂。37 ℃孵育30 min,洗涤5次。加显色液A、B,37 ℃避光显色15 min,加终止液。用酶标仪测定测量各孔的吸光度(OD)值,最后将OD值代入标准品的多项式二次回归方程,确定最终浓度。

1.8Western印迹检测心肌组织P38MAPK蛋白表达 将心肌组织加入RIPA裂解液,研磨,离心10 min,取上清,测定蛋白浓度。根据蛋白定量的结果,加入相应体积的总蛋白样品与4×上样缓冲液,95 ℃变性10 min,室温平衡。将样品加入配好的凝胶孔中,50 V进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),后湿转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脱脂奶粉封闭2 h,分别在孵育盒中孵育一抗P38MAPK(1∶800),4 ℃反应过夜,用1×PBST洗涤3次,每次10 min。孵育二抗,常温90 min,用1×PBST洗涤3次,每次10 min。ECL试剂盒曝光胶片,将胶片扫描后,用ImageJ软件测定条带灰度值。以β-actin为内参。

1.9实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测心肌组织中P38MAPK mRNA表达水平 用Trizol提取心肌组织中总RNA,然后将其逆转录为cDNA,并进行实时荧光定量PCR检测。引物序列(5′-3′):P38MAPK(106 bp):上游:CTCGGTGTGTGCTGCTT TTGAT,下游:CTCCCTGTAGGTCCTTTTGGCG;β-actin(93 bp):上游:CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGA,下游:AGGAAGAGGATGCGGCAGTGGC。预变形95 ℃,15 min后,95 ℃变性10 s、退火30 s、72 ℃延伸30 s,40个循环。采用2-△△Ct法进行数据的相对定量分析。

1.10统计学分析 采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析、LSD-t法。

2 结 果

2.1消饮化瘀方对大鼠心肌组织形态学变化的影响 HE染色结果显示:空白组可见心肌细胞横纹清楚,排列整齐,无肌纤维断裂,胞质均匀,表明心肌为正常结构;模型组可见心肌细胞排列紊乱,心肌间质水肿,肌纤维断裂,伴有大量的慢性炎症细胞浸润,出现明显的心肌纤维化特征;各治疗组与模型组相比,心肌细胞排列变整齐,无心肌纤维断裂。见图1。

图1 各组心肌组织形态学(HE染色,×200)

2.2消饮化瘀方对心肌组织Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量的影响 与空白组相比,模型组Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量均明显升高(P<0.01);与模型组相比,各治疗组Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量均有所下降,其中除中药低、中剂量组Hyp,中药低剂量组ColⅢ疗效不明显外,其他各指标均明显下降(P<0.05,P<0.01)。见表1。

表1 各组Hyp、ColⅠ、ColⅢ型含量 mRNA和蛋白表达比较

2.3消饮化瘀方对心肌组织P38MAPK蛋白及mRNA表达水平的影响 与空白组相比,模型组P38MAPK蛋白及mRNA含量明显升高(P<0.01);与模型组相比,各治疗组P38MAPK蛋白及mRNA含量明显降低(P<0.05,P<0.01)。见表1、图2。

1～6:空白组、模型组、美托洛尔组、中药低、中、高剂量组

3 讨 论

中医将CHF归属于“心悸”“喘证”“水肿”“支饮”“心水”的范畴,认为心阳不足,鼓血无力,导致瘀血水饮内停是其发病机制。2014年《慢性心力衰竭中医诊疗专家共识》也指出了痰饮和瘀血在CHF中的重要性,提出活血化痰利水的治法〔11〕。消饮化瘀方是根据《金匮要略》“病痰饮者,当以温药和之”的治疗原则,选用苓桂术甘汤合葶苈大枣泻肺汤为主方,加丹参、川芎、葛根组成。丹参、川芎、葛根经现代药理学研究具有抗炎〔12〕、抗纤维化〔13〕、保护心脏〔14〕等作用,是治疗心血管病的常用药对。方中桂枝、甘草相伍,还具有温补心阳的作用;丹参除活血之功外,尚有补血之力。故消饮化瘀方温阳补血,消饮化瘀,标本兼治,重在治标,契合CHF早期病机。

心肌纤维化的主要特征是ECM的过度沉积〔15〕。ColⅠ和ColⅢ是构成ECM的主要结构蛋白。ColⅠ约占心肌胶原总量的85%,负责建立厚纤维,赋予其抗拉伸强度。ColⅢ占正常心脏胶原蛋白总蛋白的11%,以细纤维的形式聚集,负责基质网络的弹性〔10〕。当心脏受到病理因素刺激时会生成大量的ColⅠ和ColⅢ,形成ECM,ECM过度沉积会导致心肌间质增生,炎性细胞浸润,肌纤维排列紊乱、断裂,导致间质纤维化,从而引起心脏舒缩功能障碍〔16〕。心脏组织中Hyp含量代表大鼠心脏中胶原总量,反映了心肌纤维化的程度〔17〕。本研究说明,CHF大鼠心脏受到了刺激释放出大量ColⅠ、ColⅢ,合成ECM,导致心肌中胶原含量过高;消饮化瘀方可以减轻病理因素对CHF大鼠心脏的刺激,减少ColⅠ、ColⅢ的分泌,使ECM的合成降低,平衡心肌中胶原蛋白的含量,改善CHF大鼠心肌纤维化,但与消饮化瘀方的剂量存在一定的效应关系。

MAPK信号通路是参与心肌细胞炎症、凋亡及间质纤维化的汇聚点〔4〕。P38MAPK作为MAPK的主要亚族,参与了心肌纤维化的全过程。P38MAPK可通过影响胶原蛋白的合成及心肌纤维化细胞的分化调控心肌纤维化的发生、发展〔18〕。相关研究表明,使用P38抑制剂(SB203580)可明显改善缺血再灌注导致的心肌损伤〔19〕,减少心肌梗死大鼠的心肌胶原含量〔20〕。罗丽芳等〔21〕研究发现,桃叶珊瑚苷可通过抑制P38MAPK通路来调控心肌成纤维细胞的增殖和ECM的生成。肖海等〔22〕研究发现,氧化苦参碱可通过抑制P38MAPK磷酸化,从而抑制TGF-β1诱导心肌成纤维细胞增殖的作用及相关胶原蛋白的表达,改善心肌纤维化。因此P38MAPK可作为治疗CHF心肌纤维化的靶点之一。本研究结果说明,消饮化瘀方可以通过抑制P38MAPK的表达,从而影响ColⅠ、ColⅢ及HYP的合成,改善CHF大鼠心肌纤维化。

同时,本实验选用腹腔注射阿霉素为造模方法,后期易导致CHF大鼠出现不同程度的心包积液或胸腔积液,符合本次研究“水饮致病”的特点。其次CHF大鼠心脏泵血功能障碍导致体循环或肺循环瘀血,符合本次研究“瘀血致病”的特点。但缺点是未对“饮瘀致病”做一个量化标准,将在后续的研究中进行完善。

综上,消饮化瘀方对CHF大鼠防治作用机制可能与抑制P38MAPK的表达,减少心肌胶原蛋白的合成,改善心肌纤维化有关。