基于PPARγ/LXRα/ABCA1信号通路探讨芪黄疽愈方对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成的影响及其作用机制

张欣 葛建立 苏坤 张敏妹 张静 何建明 马云龙 孙云朝 楚信强

(1河北省中医院,河北 石家庄 050001;2石家庄市中医院;3北京东直门医院)

动脉粥样硬化(AS)作为心、脑血管及周围血管疾病的关键病理基础,是近年来中老年患者致死、致残的主要疾病之一。AS以动脉壁脂质沉积、细胞死亡和斑块纤维化为特征,而脂质代谢紊乱是AS发生、发展的重要因素。胆固醇逆转运(RCT)〔1〕是将体内异常代谢的脂质转运到肝脏代谢转化成胆汁,并通过肠道排出体外的过程。由此可见,肝脏在胆固醇逆转运中起重要意义,加强胆固醇逆转运并提高肝脏对脂质的正常代谢能够改善AS的进展。笔者通过前期的临床及动物实验研究证实芪黄疽愈方能够改善下肢动脉硬化闭塞症患者临床症状〔2,3〕,且能够调节动脉硬化闭塞症(ASO)大鼠脂质代谢紊乱,降低血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)水平,升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,且有效促进SR-BⅠ蛋白表达〔4～6〕,但脂质在肝脏中的代谢机制尚不明确,推测其可能与肝脏内胆固醇代谢相关。本研究以高脂饮食喂饲的ApoE-/-小鼠及同品系同周龄C57BL/6小鼠为实验对象,探讨芪黄疽愈方是否能够影响动脉粥样硬化斑块形成,通过过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ-肝X受体(LXR)α-三磷酸腺苷结合盒转运体(ABC)A1通路促进胆固醇逆转运,改善肝脏脂质代谢紊乱,从而达到抑制AS进展的目的。

1 材料与方法

1.1材料 7周龄SPF级雄性 ApoE-/-小鼠68只〔动物生产许可证号:SCXK(京)2019-0009〕和25只同品系、同周龄雄性C57BL/6小鼠〔动物生产许可证号:SCXK(京) 2016-0006〕,体质量18～20 g,均购自北京维通利华有限公司。实验动物于河北医科大学实验动物中心SPF级动物房不锈钢笼喂饲,每笼5只,动物房温度(24±1)℃,相对湿度50%～70%,明暗周期12/12 h,每周换水3次,换垫料2次。实验操作流程严格遵循河北医科大学动物实验伦理委员会的相关法规和各项规定,并通过河北省中医院实验动物福利与伦理审查。

1.2药物与试剂 中药:芪黄疽愈方神威配方颗粒剂由红花、鸡血藤、海藻、浙贝母、鬼箭羽、土鳖虫、延胡索、黄芪、黄精、牛膝组成,由神威药业生产,河北省中医院中药房机器调配;阿托伐他汀钙片(立普妥),由辉瑞药业有限公司生产,国药准字 H20051408,产品批号:CG7011。

1.3试剂与仪器 苏木素染色液、分化液、返蓝液、伊红染液(河北博海生物工程开发有限公司);中性树胶(中杉金桥);二甲苯、无水乙醇、95%乙醇(天津市永大化学试剂有限公司);石蜡(上海华灵康复器械厂);油红O染色液(武汉塞维尔生物科技有限公司);异丙醇(国药集团化学试剂有限公司);OCT冰冻切片包埋剂(樱花,货号4583);PPARγ一抗(武汉三鹰公司,货号16643-1-AP);LXRα一抗(武汉三鹰公司,货号14351-1-AP);ABCA1一抗(武汉博士德,货号BA1541-2);Trizol(ambion,货号175805);氯仿(天津市科密欧,货号20161107);异丙醇(天津市永大,货号20160108);无水乙醇(天津市永大,货号20180606);DEP水(北京索莱宝,货号E174);HiFiScript gDNARemoval cDNA Syntheris Kit(康维世纪,货号60530)ChemoHS qPCR Mix(None ROX,莫纳生物,货号140449)。

1.4仪器 生物安全柜(广州瑞智净化设备有限公司,SW.TFG-15);光学显微镜(日本OLYMPUS,BX43);石蜡切片机(德国莱卡,RM2016);电脑生物组织摊烤片机(浙江省科迪,KD-T);电热恒温水浴锅(天津泰斯特,DK-98-11);照相机(佳能,D70);低温高速离心机(Eppendorf公司,centrifuge5417R型);超纯水仪(北京康铭泰克科技发展有限公司);蛋白浓度定量仪(Eppendorf公司,22331 hamburg型);电泳仪(北京六一公司,DYCZ-24DN型);半干转膜仪系统(ATTO公司,WSE-4040型);转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造有限公司,TS-8型);移液器(Eppendorf公司,10 μl/20 μl/200 μl/1 000 μl);CFX Manager实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)仪96孔(美国Bio-Rad公司);PCR八连管美国Axygen公司(批号:KBSW1);微量核酸分光光度计ND-1000 美国Thermo Scientific公司;分析仪器(Tanon 公司,Tanon1600型)。

1.5动物分组与造模 动物适应性喂养1 w后,ApoE-/-小鼠更换为高脂饲料,C57BL/6J小鼠继续普通对照饲料喂养,自由采食摄水,1 w后分组给药。68只ApoE-/-小鼠随机分为模型组24只,中药组22只,对照组22只。25只C57BL/6小鼠作为空白对照组。

1.6给药方法 空白组:给予0.9%氯化钠溶液(0.2 ml/20 g小鼠)灌胃,1次/d,连续12 w,自由饮水。模型组:给予0.9%氯化钠溶液(0.2 ml/20 g小鼠)灌胃,1次/d,连续12 w,自由饮水。中药组:芪黄疽愈方颗粒与生理盐水配比为质量浓度0.54 g/ml的水溶液,置于4 ℃冰箱冷藏备用,给予中药液(0.2 ml/20 g小鼠)灌胃,1次/d,连续12 w,自由饮水。对照组:阿托伐他汀钙片26 mg研磨成细末,以100 ml生理盐水调成配比为质量浓度0.26 mg/ml的悬混液,每次摇晃混合均匀后予小鼠(0.2 ml/20 g小鼠)灌胃,1次/d,连续12 w,自由饮水。于12 w时,随机从空白组、模型组各取小鼠3只,麻醉处死后,取腹主动脉行苏木素-伊红(HE)切片后可见空白组腹主动脉管壁未见斑块,模型组腹主动脉管腔多发斑块,证实造模成功。

1.7标本采集及处理方法 实验过程中,因灌胃操作模型组死亡2只,中药组死亡2只,实验结束前,空白组、对照组随机各2只用于实验预操作。12 w后,4%水合氯醛溶液(0.2 ml/20 g)腹腔麻醉处死小鼠,取小鼠自主动脉弓至髂动脉分叉处主动脉,一部分置于冻存管中,于-80 ℃冰箱冻存,一部分置于10%甲醛保存,以备检测。取出肝脏组织,肝左叶-20 ℃保存,制备冰冻切片,行油红O染色;肝右叶4%多聚甲醛溶液固定,制备石蜡切片,进行HE染色;剩余部分组织置于冻存管中,-80 ℃保存,待行Western印迹、PCR检测。

1.8检测指标 (1)一般状态:观察大鼠一般状态,包括精神状态、毛色、活动灵敏度、饮食、饮水及体质量。(2)HE染色、油红O染色观察小鼠主动脉病理变化:(1)HE染色。包埋、切片:小鼠主动脉组织经固定后,切取约15 mm长的管腔,放入包埋盒,依次脱水、浸蜡,包埋,制成石蜡块,使用切片机切5 μm厚石蜡切片;入二甲苯脱蜡,苏木素染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片;通过光学显微镜观察,选取目标区域进行拍照。(2)油红O染色。将小鼠主动脉血管周围脂肪组织用镊子尽可能去除后,置于固定液固定24 h,后将组织从固定液中取出,PBS浸洗2次。再次摘除血管外周脂肪并用解剖剪沿着血管壁小心将血管纵向剖开。将剪好的血管用自来水稍洗5 s,血管先浸入60%异丙醇3 s再浸入油红O染色液中37 ℃染色60 min后取出,用镊子取出血管浸入60%异丙醇分化,分化至管腔内脂肪斑块呈橘红色或鲜红色,其他部位近无色,后用蒸馏水洗终止分化。将血管取出,滤纸吸去多余水分平铺放在刻度尺上,选择光线良好处,调整焦距曝光度,拍照。并应用Image-Pro Plus进行图像处理。(3)HE染色、油红O染色观察肝脏组织病理学形态变化:①HE染色。将小鼠主动脉、肝脏组织分别从4%多聚甲醛固定液中取出脱水,用石蜡包埋之后在组织切片机上作5 μm连续切片,然后常规HE染色,树胶封片,光学显微镜下观察小鼠主动脉、肝脏组织病理学变化情况并拍照。②油红O染色。切片机预冷,OTC 固定液固定肝组织小块15 min,切片厚度 10～15 μm,进行常规油红O染色,水溶性树胶封片,显微镜下观察肝脏脂滴分布情况并采图。(4)Western印迹检测PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表达:①将待测样品分别称重,剪碎后于液氮中研磨至细粉末状,分装于离心管中,加入RIPA裂解液,充分混匀,4 ℃冰箱过夜裂解。4 ℃下,12 000 r/min离心10 min,取上清备用,测定蛋白浓度。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶板,根据蛋白定量结果,加入相应体积的总蛋白样品与4倍蛋白质上样缓冲液,轻轻混合,95 ℃变性10 min后室温平衡。恒压电泳,将凝胶上分离到的蛋白条带通过半干转的转膜方法(转膜时间PPARγ:38 min;LXRα:34 min;ABCA1:130 min)转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜固相支持物上,采用封闭2 h后依次与一抗(PPARγ为1∶800;LXRα为1∶800;ABCA1为1∶500)孵育过夜,洗涤后放入二抗(山羊抗兔) 孵育 90 min,曝光显色后扫描处理,所得条带吸光度值分别与对应内参计算比值获得相对吸光度值,用Tanon Gis软件测定条带灰度值。(5)RT-PCR 检测PPARγ、LXRα、ABCA1mRNA表达:设计引物序列(5′-3′):PPARγ上游:GTTGATTTCTCCAGCATTTC,产物长度:119 bp,下游:TTGATCGCACTTTGGTATT;LXRα上游:GCCTCAATGCCTGATGTTTCTC,产物长度158 bp,下游:GCTGACTCCAACCCTATCCCTAA;ABCA1上游:CCCCTTGAACCTCACTAAAC,下游CCACATAATTGCACATATCCC,产物长度233 bp。取肝脏组织50 mg研磨成粉状,根据PCR试剂盒说明书操作提取肝脏总RNA,DEPC水稀释后,微量紫外分光光度计测定 RNA 的浓度及纯度。用RT KIT试剂盒逆转录得到cDNA,用RT-PCR仪扩增PCR(反应体系总体积为:20 μl反应体系加入ChemoHS qPCR Mix 10 μl,上游引物(10 μmol/L)、下游引物〔(10 μmol/L)各0.4 μl,cDNA 100 ng,RNase-Free ddH2O 20 μl〕,以GAPDH /β-actin作为内参基因,2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.9统计学分析 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1小鼠一般状态 空白组皮毛水润光泽,精神状态良好,活跃,饮食饮水正常;模型组精神萎靡,皮毛晦暗,倦怠懒动,饮食差,饮水正常;与模型组相比,中药组及对照组给药后各症状均有不同程度改善。

2.2各组主动脉HE、油红O染色结果 空白组主动脉切片未见AS斑块,主动脉大体标本未见明显红染脂质;与空白组相比,模型组主动脉切片可见斑块,大体标本可见明显红染脂质;与模型组相比,中药组及对照组动脉切片中AS斑块面积较小,大体标本中红染脂质面积较小,见图1。

图1 各组主动脉

2.3各组肝脏HE、油红O染色结果 小鼠肝脏切片可见空白组肝细胞结构正常,细胞核位于细胞中央,细胞沿中央静脉为中心向四周放射排列,未见脂肪变性;油红O未见红染脂质;与空白组比较,模型组肝细胞排列紊乱,胞内可见形态不同、大小不等、数量不一的脂滴空泡,油红O切片可见大量红染脂质。与模型组比较,对照组、中药组肝脏病变程度减轻,肝细胞结构大部分清晰可见,脂滴数量减少,油红O红染脂质明显减少,其中空白组肝脏油红O阳性细胞面积为(39.72±15.52)μm2,模型组为(2 624.32±96.28)μm2,中药组为(287.92±45.57)μm2,对照组为(1 343.32±133.20)μm2,见图2。

图2 各组肝脏组织病理(×100)

2.4Western印迹检测肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表达 与空白组相比,模型组PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组相比,中药组以上指标显著升高(P<0.05),见图3、表1。

表1 各组肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白和mRNA表达

图3 各组肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表达

2.5PCR检测肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表达 与空白组相比,模型组PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表达明显降低(P<0.05);与模型组相比,中药组以上指标显著升高(P<0.05),见表1、图4。

图4 PCR检测肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表达

3 讨 论

AS 主要是巨噬细胞和动脉壁平滑肌细胞过多的胆固醇累积导致细胞泡沫化,促进细胞内过量胆固醇流出是预防和治疗AS的有效策略〔7,8〕。RCT既可以减少脂质在体内的堆积、维持胆固醇的体内平衡,还能够抑制动脉管壁的脂质沉积,改善血管壁重构〔9〕,而肝脏作为人体最重要的脂质代谢器官,在RCT过程中起重要作用,因此通过调节肝脏脂质代谢及RCT,改善AS脂质沉积具有重要临床意义。

PPARγ为PPAR家族一员,主要分布于肝脏和脂肪组织中,且可通过各种途径介导胆固醇的流出,对胆固醇代谢发挥重要作用〔10,11〕。LXR作为体内脂质平衡稳定的主要调节器,是PPARγ的直接靶基因〔12〕,能够通过控制 ABCA1、ABCG1 和 CETP 调节胆固醇逆转运,使得胆固醇能够从外周进入肝脏,并在肝脏内转化为胆汁酸最终排出体外〔13〕。本实验结果表明,芪黄疽愈方调节PPARγ/LXRα/ABCA1信号通路,可能与改善肝脏脂质代谢、促进RCT有关。

中医中“膏粱”“脂膏”的阐述及其特性与现代医学中的血脂具有极高一致性。若膏脂在体内的输布运化紊乱,则久之成浊,病从中生〔14〕。AS患者其病因多为痰中有瘀,瘀中有痰,痰瘀互结,留于经络,日久成为癥积,阻碍气机运行而发病,因此“癥积阻络”为其核心病机。芪黄疽愈方以“消癥通络”〔15〕为治疗大法,化癥积,通经络,诸症悉除。

综上,芪黄疽愈方能够改善小鼠动脉硬化及肝脏的脂质沉积程度,其作用机制可能是通过PPARγ/LXRα/ABCA1信号通路,调节肝脏脂质代谢,促进胆固醇逆转运,延缓动脉硬化进展。