利用CRISPR/Cas9构建敲除小鼠模型研究PPP2R3A基因对心脏功能的影响

李洁 崔晓花 梁媛 李小凤 宋贵波

(1昆明医科大学第一附属医院医学检验科,云南 昆明 650032;2云南省检验医学重点实验室;3云南省医学检验临床医学研究中心)

蛋白磷酸酶(PP)2以前称为 PP2A,是一种重要的丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)蛋白磷酸酶。PP2调节细胞周期和信号传导中的各个磷酸化反应,因而在细胞增殖、分化、凋亡中起重要作用,并与肿瘤和神经退行性疾病的发生相关〔1〕。PP2全酶由一个65 kD的结构亚基A(PR65)、一个36 kD的催化亚基C和一个调节亚基B组成。调节亚基B包括至少26种结构与功能各不相同的成员,可分为4个家族:B(PR55)、B′(PR61)、B″(PR72/PR130)及B‴(PR93/PR110)。PPP2R3A即蛋白磷酸2调节亚基B″家族α亚型(PP2A-B″α)〔2〕。

以上研究表明,PPP2R3A参与心脏的发育。PR72 和 PR130 是PPP2R3A的两种不同转录本。同源性比对发现它们在人、小鼠、大鼠和斑马鱼中是高度保守的〔3〕。当敲除PR130或PR72基因后,斑马鱼出现了心脏发育缺陷,表现为心肌细胞减少、心肌细胞凋亡增加、心室扩大和心脏功能下降(射血面积减少和射血分数缩短)〔3,4〕PPP2R3A定位于心肌细胞的 Z 线和 M 线,并在缺血性心力衰竭患者心肌样本中表达升高〔5〕。简而言之,PPP2R3A缺失会影响心脏发育,导致心脏疾病的发生。然而,PPP2R3A参与心脏发育异常的分子调控网络尚未完全清楚。大部分的蛋白都是和分子伴侣作用或是与其他蛋白质形成复合物来表征其功能,而PPP2R3A也不例外。在前期研究中,本课题组已通过酵母双杂交筛选出与PPP2R3A潜在作用的19种蛋白〔6〕,本研究拟以CRISPR/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠中PPP2R3A基因,以揭示该基因及其互作蛋白在心脏发育中的影响,并为机制研究提供信息。

1 材料和方法

1.1C57BL/6-PPP2R3A小鼠模型的构建 基因敲除小鼠(雄性3只和雌性2只)的构建委托广州赛业生物科技有限公司完成,简述如下:根据Gebank上报道的小鼠PPP2R3A序列3号外显子设计sgRNA靶向序列,并以此为依据合成一对引物(gRNA1:CCGGCTGGGGACTACTTGGAAGG,gRNA2: GATCTGTTCATGGTTACTGCAGG)进行重组质粒构建。待体外转录为RNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代阳性小鼠;F0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配,获得聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠。

1.2敲除小鼠基因型鉴定 剪取出生1 w新生小鼠尾巴,加入消化液后进行小鼠基因组DNA提取,具体提取方法按试剂盒说明书进行。取1.5 μl基因组DNA进行PCR和Sanger测序以鉴定小鼠基因型。鉴定后,基因PPP2R3A缺失型小鼠为KO组,野生型C57BL/6小鼠为WT组(雄性3只,雌性2只)。PCR引物跨越靶位点,序列为:PPP2R3A上游引物:5′-CATTCCCTAGAAACATGCTTACTGCC-3和PPP2R3A下游:5′-AACCTGTGCTTAACGCCAG AGC-3′。PCR条件为94 ℃预变性3 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 35 s,72 ℃ 5 min,共35个循环。测序引物为PCR下游。

1.3敲除小鼠的有效性验证 苏木素-伊红(HE)染色:通过颈椎脱臼法处死小鼠,取出心脏并切成厚度约0.5 cm的组织块,浸入4%多聚甲醛液中固定后依次放入由低到高浓度乙醇(50%、70%、80%、95%和100%)中逐渐脱去组织中的水分,再将组织块置于二甲苯中透明后浸蜡包埋,随后放入冰冻切片机箱内切片,切片切出后利用该组织切片与载玻片的温差立即贴片并烘干后进行HE染色,光镜下观察。荧光定量PCR(qPCR):取心脏组织匀浆后提取总RNA,反转录后以qPCR进行PPP2R3A表达检测。引物序列为PPP2R3A上游引物:5′-GACATCTTTGCGAAGGGACC-3′;下游:5′-GACTTCAG CCTCTTCTTAAACCG-3′;磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内部对照。Western印迹:将心脏组织放入RIPA缓冲液中冰上匀浆,4 ℃离心15 min以除去不溶性物质。使用二喹啉甲酸(BCA)TM蛋白质测定试剂盒对蛋白质进行定量后放入-80 ℃冰箱中下冻存备用。蛋白样品通过8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,随后转移到0.45 μm的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脱脂奶粉在Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)中室温封膜2 h。用稀释的一抗(兔抗鼠PPP2R3A 1∶500稀释)在4 ℃孵育膜过夜后添加二抗(羊抗兔IgG 1∶1 000稀释),室温孵育1.5 h后观察蛋白。选用β-actin(1∶1 000稀释)作为内部对照。

1.4G蛋白信号转导调控因子(RGS)19表达检测 免疫组织化学染色(直接荧光法):心脏组织的石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理后水化,用0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min,冷风吹干,放入湿盒中滴加经稀释的荧光抗体(1∶2 000,PA5-23210),置于37 ℃孵育60 min,PBS冲洗后用50%甘油缓冲液封片,荧光显微镜下检查。Western印迹:蛋白质样品通过SDS-PAGE分离,然后转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭1 h后,将膜与靶蛋白通过其特异性一抗和辣根过氧化物酶缀合的二抗进行检测。

1.5统计学分析 采用SPSS25.0软件进行独立样本t检验。

2 结 果

2.1CRISPR/Cas9微注射法成功建立PPP2R3A敲除小鼠模型 为了构建PPP2R3A基因敲除小鼠模型,设计了靶向PPP2R3A序列3号外显子翻译起始密码子的sgRNAs,并将sgRNA及Cas9 mRNA一起显微注射到小鼠胚胎中;所选择的小鼠系拥有一个113 bp的缺失突变,发现113 bp的差异足以区分WT组和KO组PCR产物。Sanger测序证实了基因PPP2R3A的敲除。见图1～3。

图1 生成KO小鼠的CRISPR/Cas9靶向策略:靶向位点用黑色箭头表示

图2 PPP2R3A WT和F1代杂合子KO小鼠的PCR基因分型

图3 KO小鼠基因组 DNA的测序鉴定

2.2敲除小鼠心脏组织中PPP2R3A表达降低 从胚胎发育到成年,PPP2R3A在人类心脏中都有强烈表达,这表明PPP2R3A可能在它们的成熟和功能中发挥重要作用。与WT组相比,KO组心脏组织中PPP2R3A mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表1、图4。

表1 两组RGS19蛋白相关表达、PPP2R3 mRNA及蛋白相对表达比较

图4 Western印迹检测两组心脏组织中PPP2R3A、RGS19蛋白相对表达

2.3参与心脏发育的调节蛋白RGS19在心肌细胞中表达上调 蛋白RGS19广泛表达于正常的心肌细胞胞质内,呈均匀的棕褐色;但在PPP2R3A蛋白表达受损的心肌细胞胞质内,RGS19表达量增高,颜色变深,局部呈灶状分布。与WT组相比,KO组心肌细胞RGS19蛋白水平显著上调(P<0.05)。见表1、图4、图5。

图5 两组心脏组织及心肌细胞RGS19蛋白表达(×200)

2.4PPP2R3A敲除引起心脏组织病理变化 HE染色显示,KO组心肌细胞肥大,排列紊乱,而WT组未见明显变化。见图5。表明在PPP2R3A敲除突变体中,PPP2R3A蛋白表达受损引起心脏组织病理学变化。

3 讨 论

本研究观察到敲除PPP2R3A后,小鼠心脏组织出现心肌细胞肥大,排列紊乱等形态学异常。心肌细胞这种病理改变可能是因为PPP2R3A基因的敲除可以抑制心肌细胞增殖并轻度增加心肌细胞的早期凋亡〔6〕。本研究还观察到PPP2R3A缺失后,受损的心肌细胞内RGS19表达上调,与过表达RGS1转基因小鼠观察到的结果相似(室间隔缺损和室壁变薄)〔7〕。此外,有研究报道了RGS19可通过灭活Galpha(o)亚基,进而抑制散乱蛋白(Dsh或Dvl)磷酸化、β-连环蛋白(catenin)聚集和Wnt应答基因转录,从而阻断小鼠F9畸胎瘤细胞中Wnt/β-catenin通路诱导的细胞分化〔8〕。表明RGS19影响心脏发育并对心脏功能产生负面影响。本课题组前期已成功构建人心肌细胞cDNA文库,通过酵母双杂交筛选及阳性克隆鉴定、测序比对,发现PPP2R3A与参与调控心脏发育的Wnt信号通路靶向调节蛋白RGS19存在体外相互作用〔4〕。由此本文推测PPP2R3A可能通过RGS19调控Wnt通路影响心脏发育和功能,将来本研究会继续阐明PPP2R3A与RGS19是如何通过Wnt/β-catenin 信号通路影响心脏发育和功能的机制,为心脏疾病的诊疗及心脏再生策略提供新的思路和方向。