不同品种哈密瓜果实脯氨酸代谢对低温的响应

毕 莹，王新宇，李 慧，黄 帅，张 琪，雷雅馨，王 雪，王富鑫，许文昌，王 静

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

哈密瓜（Cucumis melovar.saccharinus）属葫芦科、甜瓜属、厚皮甜瓜类，是新疆传统的名优特产，其肉质松脆、味道香甜、营养丰富，深受国内外消费者的喜爱[1]。但哈密瓜果实生理代谢旺盛，产季集中且采收温度较高，采后衰老和品质劣变迅速，易造成大量经济损失[2]。低温冷藏是哈密瓜果实保鲜最有效的方法之一，适当的低温可有效抑制其果实采后呼吸作用和乙烯的生成，延缓果实衰老，减少果实采后腐烂损失。但哈密瓜果实对低温环境敏感，不适宜的低温易引起冷害。冷害的发生严重降低了哈密瓜果实采后品质，影响其商品附加值，限制了低温冷藏及冷链物流技术在哈密瓜采后保鲜领域的应用与推广[3]。因此，探究哈密瓜果实发生冷害症状的机理，有助于缓解哈密瓜产业的浪费问题以及振兴新疆地区果蔬产业的经济。

国外研究显示，脯氨酸作为细胞内的渗透调节物质，在提高果蔬的抗冷性方面发挥非常重要的作用。当果蔬受到低温胁迫时，脯氨酸会开始大量积累，它可以增加细胞渗透压，稳定细胞膜和亚细胞结构，保护细胞免受应激下的氧化损伤，从而维持细胞膜的完整性，提高植物的抗冷性[4-5]。李小安[6]在研究低温胁迫对不同扁蓿豆种子内游离脯氨酸的影响时发现，低温胁迫可以通过提高植物体内游离脯氨酸含量从而适应低温逆境、减轻低温伤害，增强其抗冷能力。陈代慧等[7]探究低温胁迫对不同品种山茶花的影响，结果发现在低温环境中存放越久，体内脯氨酸含量越高。陈智智[8]在对桃果实进行外源脯氨酸处理后，发现脯氨酸能通过提高Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrrolidine-5-carboxylic acid synthase，P5CS）、鸟氨酸转氨酶（ornithine transaminase，OAT）和谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）的活性，降低脯氨酸脱氢酶（proline dehydrogenase，ProDH）的活性，明显降低桃果实的冷害指数，延缓冷害症状的发生。李大红等[9]在研究如何提高羽衣甘蓝的抗寒性时，发现P5CS基因能显著提高转基因羽衣甘蓝脯氨酸的合成速度，此外P5CS还参与了其他的代谢调控，能够增加渗透调节物质、减轻细胞质膜的氧化，从而在整体上提高了羽衣甘蓝的抗寒性，该实验结果说明P5CS是植物通过脯氨酸代谢提高耐冷性途径中的关键酶。果蔬冷害的发生影响了脯氨酸的含量，而脯氨酸作为氨基酸的一种，氨基酸总量也与冷害有密切的联系。冯双庆等[10-11]在研究冷害温度下番茄和黄瓜的氨基酸含量变化时发现，冷害的发生会降低番茄和黄瓜体内总氨基酸含量。刘平香[12]对大蒜贮藏过程中的特征成分进行分析，结果发现代谢组学实验可以对代谢物进行定性和相对定量分析。

已有研究表明，从普通菜豆中分离克隆得到了P5CS酶的基因PvP5CS1和PvP5CS2[13]。在渗透调节的逆境胁迫前期阶段均会出现PvP5CS1和PvP5CS2mRNA的积累，而脯氨酸积累则是出现在中后期阶段，PvP5CS1和PvP5CS2mRNA的积累明显比脯氨酸积累要早。在渗透和胁迫环境条件影响下，PvP5CS1和PvP5CS2基因与AtP5CS1[14]和OsP5CS1[15]基因类型一样，在促进脯氨酸的合成转化中可起到十分重要的调控作用。由此说明，测定P5CS基因类型对研究脯氨酸代谢有十分重要的意义。因此，研究脯氨酸及其代谢过程中的关键酶P5CS在逆境胁迫下的调控机理和抗性机制有利于果蔬抵御不同程度的侵害。但是对哈密瓜果实采后此方面的研究目前鲜见相关报道，而研究主要集中在细胞膜脂[16]、活性氧[17]、渗透调节物质[2]等方面，其中对哈密瓜果实低温胁迫下脯氨酸代谢的表达分析主要集中在某一品种上，缺少耐冷性强和弱的品种之间的研究。

本研究重点分析在低温贮藏环境中耐冷性较弱的早熟‘西周密25号’和耐冷性较强的晚熟‘伽师瓜’果实脯氨酸代谢、氨基酸总量以及冷害发生的差异，并通过全基因合成哈密瓜果皮CmP5CS基因类型，探究抗冷性不同的哈密瓜果实在低温胁迫中的应答机理，旨在为哈密瓜果实采后的贮运保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘西周密25号’哈密瓜（可溶性固形物质量分数为13.44%），于2022年7月15日采收于新疆维吾尔自治区五家渠市商品瓜基地；‘伽师瓜’哈密瓜（可溶性固形物质量分数为9.17%），于2022年8月9日采收于新疆维吾尔自治区喀什地区伽师县商品瓜基地。同一个品种选择成熟度基本相同、大小均一、无病虫害、无腐烂和无机械损伤的瓜进行采摘，采摘时留取2～5 cm果柄，将采后哈密瓜果实单独套装发泡网，每4 个装于1 个标准纸箱，立即运送至新疆农业大学食品科学与药学学院504实验室进行清洗，随即运至（3.0±0.5）℃冷库内贮藏（根据刘同业[18]、安瑞丽[19]等的研究结果，‘西周密25号’和‘伽师瓜’哈密瓜果实均能在3 ℃下发生冷害症状）。

磺基水杨酸、茚三酮、甲苯 天津市大茂化学试剂厂；冰乙酸 天津市鑫铂特化工有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾 天津市科密欧化学试剂有限公司；丙三醇 国药集团化学试剂有限公司；聚乙烯吡咯烷酮 安徽Biosharp公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、氢氧化钠 天津市福晨化学试剂厂；酮戊二酸 上海展云化工有限公司；L-鸟氨酸 美国Sigma公司；还原型辅酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、NAD＋美国BioFRoxx公司；二硫苏糖醇 北京Solarbio公司；Tris、氯化钾、氯化镁 广东方信生物科技有限公司；谷氨酸钠天津市凯通化学试剂有限公司；盐酸 珠海市华成达化工有限公司；无水碳酸钠、碳酸氢钠 天津市永大化学试剂有限公司；以上所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

QL-861涡旋振荡器 江苏省海门市麒麟鳞医用仪器厂；PTT-A＋200电子天平 福州华志科学仪器有限公司；DZKW-S-4电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司；SF-GL-16A高速冷冻离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司；P4PC型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；XW-80A高速分散器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；DW-40L92医用低温保存箱青岛海尔特种电器有限公司；SW-CJ-2D洁净工作台苏州净化设备有限公司；Mini Pro 300V Power Supply电泳仪 美国Major Science公司；EDC-810普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪北京东胜创新生物科技有限公司；MA-6000实时PCR（real-time PCR）仪 苏州雅睿生物技术有限公司；2500凝胶成像系统 上海天能公司；AB Sciex QTRAP 6500＋质谱仪 美国Waters公司；AB Sciex ExionLCTMAD液相色谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 冷害指数的测定

贮藏过程中，自放贮藏冷库14 d后，各品种哈密瓜分别每7 d取3 个果实3 个重复，共计9 个瓜移至室温放置5 d后，记录果实变化，共取6 次。冷害指数计算根据Bi Yang等[20]的方法，症状按严重程度分为5级（0级：果面光洁，没有冷害症状；1级：有轻微的下陷冷害斑，占果面总面积10%以下；2级：冷害面积占果面的比例在11%～25%；3级：冷害面积占果面的比例在25%～50%；4级：冷害面积占果面总面积的50%以上），分别记录两组的冷害级数，冷害指数计算公式如下：

1.3.2 游离脯氨酸含量测定

参照曹建康[21]、Gao Hui[22]等的方法，并略作修改，称取2 g哈密瓜果皮，加入5 mL经4 ℃预冷后的30 g/L磺基水杨酸溶液进行研磨提取，转入试管中煮沸提取10 min，期间摇匀3～4 次，取出冷却至室温后，于4 ℃、12 000×g条件下离心20 min，收集上清液即为游离脯氨酸提取液。吸取上清液2 mL、酸性茚三酮溶液3 mL和冰乙酸溶液2 mL摇匀煮沸30 min，待冷却后加入甲苯溶液4 mL，吸取上层溶液测定520 nm波长处吸光度，重复3 次。计算哈密瓜样品中游离脯氨酸含量，单位为μg/g。

1.3.3 脯氨酸合成关键酶P5CS活性测定

参照黄琦辉[23]、Shang Haitao等[24]的方法，并略作修改，取2 g哈密瓜果皮，加入6 mL经4 ℃预冷的Tris-HCl缓冲液研磨，于4 ℃、12 000×g条件下离心25 min，取0.2 mL上清液加入2.4 mL Tris-HCl缓冲液、0.1 mL 25 mmol/L的MgCl2溶液、0.1 mL 75 mmol/L的谷氨酸钠溶液、0.1 mL 5 mmol/L的ATP溶液，混匀后加入0.1 mL 0.4 mmol/L的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）溶液，测定反应液每30 s在340 nm波长处的吸光度变化，重复3 次。以每分钟每克哈密瓜果实吸光度变化0.001为1 个P5CS活性单位，结果用U/g表示。

1.3.4 脯氨酸合成关键酶OAT活性测定

参照黄琦辉[23]、Esteban等[25]的方法，并略作修改，取2 g哈密瓜果皮，加入6 mL经4 ℃预冷的磷酸钾缓冲液研磨，4 ℃、12 000×g离心25 min，取0.2 mL上清液加入2.2 mL 200 mmol/L的Tris-HCl缓冲液、0.2 mL 46.8 mmol/L的鸟氨酸溶液、0.2 mL 12.5 mmol/L的α-酮戊二酸溶液，混匀后加入0.4 mL 0.25 mmol/L的NADH溶液，测定反应液每30 s在340 nm波长处的吸光度变化，重复3 次。以每分钟每克哈密瓜果实吸光度变化0.001为1 个OAT活性单位，结果用U/g表示。

1.3.5 脯氨酸降解关键酶ProDH活性测定

参照黄琦辉[23]、López-Carrión等[26]的方法，并略作修改，取2 g哈密瓜果皮，加入6 mL经4 ℃预冷的Tris-HCl缓冲液研磨，于4 ℃、12 000×g条件下离心25 min，取0.2 mL上清液加入2.4 mL 0.15 mmol/L的碳酸钠缓冲液、0.2 mL 2.67 mmol/L的脯氨酸溶液，混匀后加入0.2 mL 10 mmol/L的NAD＋溶液，测定反应液每30 s在340 nm波长处的吸光度变化，重复3 次。以每分钟每克哈密瓜果实吸光度变化0.001为1 个ProDH活性单位，结果用U/g表示。

1.3.6 real-time PCR

采用real-time PCR测定P5CS、OAT、ProDH基因相对表达量，提取RNA，设计引物CmP5CS-F、CmP5CS-R、CmOAT-F、CmOAT-R、CmProDH-F、CmProDH-R、18S-F(NEI)、18S-R(NEI)，cDNA合成与real-time PCR引物分析，根据本实验中冷害发生的关键时间点，取贮藏在（3.0±0.5）℃条件下14、28、42 d的两种哈密瓜果实，采用2-ΔΔCt分析方法，在赤道周围约取2 cm厚的哈密瓜皮组织用来提取总RNA，取1 μL总RNA反转录成cDNA，然后取1 μL cDNA进行real-time PCR。

1.3.7 液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）测定氨基酸含量

参考Sun Lulu等[27]的方法，液氮研磨样本，称取一定量的样本加入质谱水中，涡旋混匀为稀释样本；取稀释样本50 μL，加入200 μL含混合内标的沉淀剂（乙腈-甲醇（1∶1，V/V）），涡旋混匀，冰上静置30 min，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，取全部上清液进行LC-MS分析，每个样品重复3 次，根据组间差异使用hiplot网站制作主成分分析（principal component analysis，PCA）图。

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A相：含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液、B相：含0.1%甲酸的乙腈；柱温：50 ℃；进样量：1 μL；流速：0.3 mL/min。

质谱条件：电喷雾电离源，正离子电离模式。离子源温度550 ℃，离子源电压5 500 V，气帘气压35 psi，雾化气压50 psi，辅助气压60 psi。采用多反应监测进行扫描。

1.3.8 全基因合成

对本研究所得脯氨酸代谢结果进行分析，确定P5CS基因表达差异的显著性，后续使用全基因合成法对该基因进行合成。

1.4 数据处理与分析

实验数据由WPS 2021及Origin 2022软件进行数据分析并制图，利用SPSS 26.0软件对数据进行统计及显著性分析，P＜0.05表示差异显著；P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 两个品种哈密瓜果实贮藏期间冷害症状和冷害指数的比较

由图1可知，‘西周密25号’在冷藏14 d后出现了冷害的症状，而‘伽师瓜’冷藏21 d才开始出现冷害症状，两个品种哈密瓜果实冷害指数差异极显著（P＜0.01）。‘西周密25号’随着冷藏时间的延长，冷害指数不断升高，在冷藏42 d时达到46.67%。‘伽师瓜’在21～35 d时均出现轻微冷害症状，冷害指数均为4.44%，42 d冷害症状严重，此时冷害指数达到6.67%。‘西周密25号’的冷害指数极显著高于‘伽师瓜’果实的冷害指数（P＜0.01），说明“西周密25号”较“伽师瓜”在低温条件下更易出现冷害症状。

图1 两个品种哈密瓜果实贮藏期间的冷害指数对比Fig.1 Comparison of chilling injury indices of two varieties of Hami melon during storage

2.2 两个品种哈密瓜果实低温贮藏期间游离脯氨酸含量的变化

由图2可知，在两个品种哈密瓜果实低温贮藏期间，游离脯氨酸含量均整体呈现上升趋势，‘伽师瓜’在0～28 d游离脯氨酸含量始终处于上升趋势，到35 d开始下降，42 d又开始升高，此时达到42.773 μg/g。‘西周密25号’随着贮藏时间的延长，游离脯氨酸含量持续升高，在42 d达到38.114 μg/g。‘伽师瓜’的游离脯氨酸含量在整个贮藏期里始终高于‘西周密25号’，其中在0 d和14 d显著高于‘西周密25号’（P＜0.05），在7、21～42 d极显著高于‘西周密25号’（P＜0.01）。说明在低温胁迫条件下，耐冷性强的‘伽师瓜’果实更能激发游离脯氨酸含量的增加。

图2 两个品种哈密瓜果实低温贮藏期间游离脯氨酸含量的变化Fig.2 Changes in free proline contents of two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.3 两个品种哈密瓜果实低温贮藏期间P5CS活性及基因表达量的变化

由图3A可知，两个品种哈密瓜果实在低温贮藏期间，P5CS活性整体呈上升趋势。‘西周密25号’和‘伽师瓜’果实分别从贮藏初期的30.800 U/g和44.800 U/g上升至贮藏结束时的86.800 U/g和126.000 U/g，分别增长了1.818 倍和1.8125 倍。由此可见，‘西周密25号’和‘伽师瓜’P5CS活性在整个贮藏期内的增长速率大致相同。但是‘伽师瓜’在第0天和14天时P5CS活性显著高于‘西周密25号’（P＜0.05），在第28～42天的P5CS活性极显著高于‘西周密25号’（P＜0.01），说明‘伽师瓜’在受到低温胁迫时，体内的P5CS响应较敏感，激发果实积累游离脯氨酸，提高其耐冷性。而‘伽师瓜’在第14～21天时，该酶的活性降低，推测可能是因为‘西周密25号’发生冷害所致。CmP5CS相对表达量如图3B所示，在第28天时，‘伽师瓜’中CmP5CS相对表达量高于‘西周密25号’，这与两个品种哈密瓜果实酶活性变化相似，其他两个时间点与酶活性差异相反。而各品种CmP5CS相对表达量的变化趋势与其对应的酶活性变化趋势相近，‘西周密25号’都呈现先下降后升高的趋势，‘伽师瓜’都呈现贮藏期内大致升高的趋势，推测CmP5CS相对表达量可能与P5CS活性以及哈密瓜果实发生冷害症状有关。

图3 两个品种哈密瓜果实低温贮藏期间P5CS活性（A）及其CmP5CS基因相对表达量（B）的变化Fig.3 Changes in P5CS activity (A) and its relative expression (B) in two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.4 两个品种哈密瓜果实低温贮藏期间OAT活性及基因表达量的变化

由图4A可知，两个品种哈密瓜果实在低温贮藏期间，OAT活性整体呈上升趋势，贮藏结束时‘西周密25号’和‘伽师瓜’果实OAT活性分别达到48.000 U/g和64.000 U/g，较贮藏初期分别增长了0.636 倍和1.010 倍，‘伽师瓜’果实的OAT保护效应较显著。‘伽师瓜’OAT活性在第7天和第21～42天期间显著高于‘西周密25号’（P＜0.05），在第14天极显著高于‘西周密25号’（P＜0.01）。CmOAT相对表达量如图4B所示，在第28天时，‘伽师瓜’的CmOAT相对表达量高于‘西周密25号’，与两个品种哈密瓜果实酶活性相似，其他两个时间点与酶活性相反，并且‘伽师瓜’CmOAT相对表达量整体增长幅度较小，“西周密25号”增长幅度较大，与OAT活性增长趋势较为相近。

图4 两个品种哈密瓜果实低温贮藏期间OAT活性（A）及其CmOAT基因相对表达量（B）的变化Fig.4 Changes in OAT activity (A) and its relative expression (B) in two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.5 两个品种哈密瓜果实低温贮藏期间ProDH活性及基因表达量的变化

由图5A可知，两个品种哈密瓜果实在低温贮藏期间，ProDH活性整体呈下降趋势。‘西周密25号’及‘伽师瓜’ProDH活性分别由原始点的80.000 U/g和56.000 U/g下降至29.333 U/g和26.667 U/g，下降幅度分别为63.3%和52.4%，‘西周密25号’下降幅度更大。‘西周密25号’在第0天和第35天ProDH活性显著高于‘伽师瓜’（P＜0.05），可能与其冷害发生程度有关，且‘西周密25号’较‘伽师瓜’的ProDH活性高。说明‘西周密25号’较‘伽师瓜’果实更能促进果实的游离脯氨酸含量下降，从而导致冷害加剧，该结果与图3和图4相印证。CmProDH基因相对表达量如图5B所示，‘西周密25号’CmProDH相对表达量在第14天和第42天均高于‘伽师瓜’，且两个品种哈密瓜果实CmProDH相对表达量在整个贮藏期呈下降趋势，与其ProDH活性变化趋势大致相同。

图5 两个品种哈密瓜果实低温贮藏期间ProDH活性（A）及其CmProDH基因相对表达量（B）的变化Fig.5 Changes in ProDH activity (A) and its relative expression (B) in two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.6 两个品种哈密瓜果实低温贮藏期间各氨基酸总含量变化

根据图6显示，各个样品的每组平行数据点在PCA图中较为靠近，证明各平行样品在主成分空间中具有相似的特征。

图6 两个品种哈密瓜果实0、14、28、42 d样品氨基酸PCA图Fig.6 PCA plot for variations in total amino acid contents in two varieties of Hami melon fruits during storage

结合图7和表1可以看出，‘西周密25号’和‘伽师瓜’果实在取样时间内，不同氨基酸含量的变化趋势及含量不同。在冷害胁迫发生过程中与脯氨酸合成密切相关的谷氨酸途径占优势，两个品种哈密瓜果实的谷氨酸含量整体呈下降趋势，且‘西周密25号’谷氨酸含量下降较快，到第42天下降幅度为89.1%，‘伽师瓜’谷氨酸含量下降幅度较小，为71.7%，说明‘伽师瓜’果实的脯氨酸含量保留较多，较‘西周密25号’果实耐冷性更强，表1中的脯氨酸含量变化也证明了该结论。

表1 两个品种哈密瓜果实不同贮藏时间下各氨基酸总含量Table 1 Total amino acid contents in two varieties of Hami melon fruits at different storage times mg/g

图7 两个品种哈密瓜果实23 种氨基酸提取离子流色谱图Fig.7 Extracted ion chromatogram of 23 amino acids detected in two varieties of Hami melon fruits

2.7 哈密瓜P5CS基因合成序列分析

为探究脯氨酸代谢中关键酶P5CS的同源性，根据以上实验结果，挑选耐冷性较差的‘西周密25号’哈密瓜进行全基因合成，测序结果经NCBI网站BLAST比对，如图8所示，通过同源进化树分析发现该片段与甜瓜（LOC103485529）的P5CSmRNA在同一分支，且同源性为100%；与黄瓜、冬瓜、西葫芦、番南瓜P5CSmRNA同源性在90%以上；与葡萄、梨、橡胶P5CSmRNA同源性在50%以上。说明哈密瓜果皮中P5CS基因与甜瓜中P5CS基因功能相同，响应冷害的机理相似。测序结果显示，P5CS基因编码蛋白质分子量为77.7，等电点为6.28。该结果可为后续筛选验证能调控脯氨酸代谢的关键上游转录因子的研究奠定基础。

3 讨论

不同品种的哈密瓜果实可能会因为采摘期、受日照时间长短、栽种土壤等不同而具有不同的冷害发生温度、时间以及冷害症状。冷害指数是判断哈密瓜冷害程度最直观的品质指标，在本实验中，‘西周密25号’从14 d开始出现浅褐色的凹陷块状斑，并随着时间的延长，冷害斑的面积越来越大，颜色越来越深，瓜体开始变软凹陷产生水浸状[28]，汁水通过变软损坏的外皮流出。‘伽师瓜’的冷害程度相较于‘西周密25号’要轻许多，在21 d时出现瓜体变软凹陷并流汁的冷害现象，在42 d后开始出现了深褐色的凹陷块状斑，以上现象说明，在哈密瓜果实出现冷害现象时，细胞膜会受到损害，反映在果皮上，在3 ℃贮藏条件下，‘伽师瓜’受到损害的程度小于‘西周密25号’，说明‘伽师瓜’的耐冷性要好于‘西周密25号’。

游离脯氨酸是果蔬体内一种非常重要的逆境胁迫响应物质，通常情况下游离脯氨酸的积累与代谢主要与OAT、P5CS和ProDH等酶有关，其中OAT和P5CS均是在脯氨酸代谢转化过程中形成的一种合成酶，ProDH是脯氨酸脱氢酶，在3 种酶的共同作用下，动态调节和控制的循环构成了果蔬体内游离脯氨酸的合成积累与自然降解的往复过程[29]。在本实验中发现，‘西周密25号’与‘伽师瓜’在整个低温贮藏期游离脯氨酸含量都明显升高，且增长速率较快，说明在低温胁迫下哈密瓜果实可以通过快速大量积累体内游离脯氨酸抵御外界破坏，减轻对果皮细胞造成的侵害。与青茄[30]、黄瓜[31]、青椒[32]、‘新密3号’哈密瓜[33]等果实在低温环境中通过提高自身的游离脯氨酸含量抵御低温胁迫的现象相似。‘伽师瓜’的游离脯氨酸含量始终显著高于‘西周密25号’，说明在3 ℃条件下‘伽师瓜’的耐冷性好于‘西周密25号’，与冷害指数的结果吻合。在整个低温贮藏过程中两个品种哈密瓜果实P5CS活性均升高，说明哈密瓜果实可以通过提高P5CS活性抵御低温胁迫，其中‘伽师瓜’的P5CS活性整体高于‘西周密25号’，这与游离脯氨酸含量的结果相对应，同时两个品种哈密瓜果实基因相对表达量也随着贮藏时间的延长而升高，与酶活性变化情况相同，证实哈密瓜果实会通过提高P5CS活性维持游离脯氨酸含量的增加，从而提高哈密瓜的抗寒性，与玉米[34]、桃[35]、枇杷[36]等果实的研究结果相似。OAT是游离脯氨酸合成过程中的关键酶，在两个品种哈密瓜果实中的变化与游离脯氨酸含量相同，在整个贮藏期内呈上升趋势，且‘伽师瓜’的OAT活性始终高于‘西周密25号’，相应基因的相对表达量也在贮藏初期至贮藏末期内升高。ProDH作为脯氨酸降解第一步中的限速酶，可以为植物提供能量[37]。在本实验中，随着低温贮藏时间的延长，两个品种哈密瓜果实ProDH活性逐渐降低，基因相对表达量在贮藏后期低于贮藏前期，说明哈密瓜果实ProDH基因的相对表达量与酶活性较为一致，该结果与罗丹等[38]、王延圣[39]和刘彩红[40]的部分研究相似。

本实验发现‘西周密25号’在冷藏中大部分氨基酸总含量随着贮藏时间的延长而降低，说明‘西周密25号’哈密瓜果实冷害症状严重，冷害的发生破坏了其细胞及蛋白质结构，消耗大量营养物质，降低其组织内的氨基酸含量，与龚晓平[41]、黄爱萍[42]等研究结果相似；而‘伽师瓜’的氨基酸总含量增加，与土坛树果实[43]、‘红地球’葡萄[44]的氨基酸变化趋势相似。该变化是否与其成熟度低有关，具体成因目前尚不可知，有待进一步探究。对耐冷性较差的‘西周密25号’哈密瓜进行全基因合成，得出哈密瓜CmP5CS与甜瓜P5CS亲缘关系很近，同源性达到100%，表明‘西周密25号’哈密瓜中P5CS基因在调控脯氨酸合成过程中与甜瓜中的P5CS基因功能相同。

4 结论

哈密瓜果实和甜瓜果实亲缘关系极近，当哈密瓜果实遭受到低温胁迫时，会通过降低ProDH活性、提高P5CS以及OAT活性提高游离脯氨酸含量，提升自身耐冷性。而冷害严重的哈密瓜果实体内能量消耗快、细胞及蛋白质结构会被破坏，从而降低果实各氨基酸的总含量。综合分析游离脯氨酸、谷氨酸及脯氨酸总量变化，说明‘伽师瓜’的耐冷性强于‘西周密25号’。