氮处理对高粱氮代谢相关基因NR、GS、GOGAT表达的影响

2024-04-08徐洪超王增雪逄洪波王兰兰李雪梅马莲菊张飞李玥莹

江苏农业科学 2024年3期

徐洪超王增雪逄洪波王兰兰李雪梅马莲菊张飞李玥莹

摘要：为了探究不同氮处理对高粱氮代谢相关酶基因表达的影响，提高高粱氮素利用率，选择最佳施氮模式，选用2个高粱品种辽粘3号、晋杂34，设置4个氮处理水平（N0：0 kg/hm2，N1：60 kg/hm2，N2：120 kg/hm2，N3：180 kg/hm2），用荧光定量PCR方法分别测定苗期、拔节期、抽穗期、成熟期高粱叶片、籽粒的NR、GS、GOGAT基因相对表达量，分析不同氮处理水平对氮代谢相关酶基因表达的影响。结果表明：除成熟期叶片外，各生育期辽粘3号、晋杂34叶片、籽粒在施氮条件下的NR、GS、GOGAT基因相对表达量均高于未施氮处理。随施氮量增加，高粱叶片和籽粒NR、GS、GOGAT基因相对表达量呈上调或先上调后下调的变化趋势。辽粘3号和晋杂34在N2、N3处理的NR、GS、GOGAT基因相对表达量处于较高水平。综合多方面因素考虑，可以将N2处理确定为最适施氮量。

关键词：氮处理；基因表达；高粱；氮代谢；基因相对表达量

中图分类号：S514.06 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）03-0079-05

高粱作为世界上第五大类粮食作物，具有生长力强、二氧化碳利用率高、需水量少等优势，在恶劣的生长环境中还具有耐盐碱、耐瘠薄、耐涝等抗逆特性［1-2］。高粱的应用十分广泛，在酿酒业、能源业、饲料业、造纸业、板材业和色素业等领域具有巨大的发展空间和优势。随着高粱的需求不断增多，产量成为其研究领域的一个重要课题。

氮素是植物生长的必需元素，主要以硝态氮和铵态氮的形式参与植物体内的氮代谢调节过程。硝酸还原酶（NR）是硝态氮转化为铵态氮的第1个关键酶，谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）是无机氮转化为有机氮的关键酶［3］，它们对氮代谢同化过程具有不可替代的作用。同时，氮素同化过程受到一系列氮代谢相关酶基因的调控。氮代谢相关酶基因会影响酶活性的表达，从而影响高粱产量和品质。房晓琨研究发现，栽培大豆的NR、GS、GOGAT活性与其对应的基因相对表达量呈显著或极显著正相关关系［4］。植物体内含N化合物的含量与氮代谢相关酶基因表达量的关系也十分密切，鲁黎明等对烤烟研究发现，烟叶可溶性蛋白含量与NR基因相对表达量呈极显著正相关关系［5］。林照辉研究发现，在一定范围内，白菜NR基因的表达随氮素浓度升高而升高［6］。宁改星等以葡萄为试材，研究发现，施氮可以影响氮代谢相关酶基因的表达，改善氮代谢水平［7］。施氮处理下的叶片NR、GS、GDH基因表达水平均高于对照。然而过量施用氮肥，会产生成本增加、资源浪费、环境污染等众多的问题［8］。所以，在保持作物产量稳定的同时，提高氮肥利用效率，减少氮肥使用量是解决问题的关键。

目前有关高粱氮代谢相关酶基因表达的报道比较少。本试验选用辽粘3号、晋杂34高粱品种，分析比较不同氮处理对不同高粱品种各生育期叶片和籽粒的NR、GS、GOGAT基因相对表达量，旨在从分子水平探究氮肥对高粱氮代谢的调控机制，为提高高粱氮素利用率、选择最佳施氮模式提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验于2021年在辽宁省农业科学院试验基地进行。试验材料是2个高粱品种辽粘3号、晋杂34，分别设置4个氮处理（N0 ：0 kg/hm2，N1：60 kg/hm2，N2：120 kg/hm2，N3：180 kg/hm2），选取苗期、拔节期、抽穗期、成熟期高粱叶片和籽粒进行试验。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取与浓度检测使用promega RNA提取试剂盒对高粱叶片和籽粒RNA进行提取。用核酸定量仪ScanDrop 200进行浓度检测［9］。

1.2.2 Sor-NR、Sor-GS、Sor-GOGAT基因引物的设计通过查找相关文献资料［10］，确定本试验引物序列（表1）。

1.2.3 反转录（1）去除基因组DNA。反应体系：5×gDNA Clean Reaction Mix 2 μL，Total RNA*1 8 μL；反应条件：42 ℃ 2 min。（2）反转录反应。反应体系：即去除基因组DNA反应液10 μL，主要包括5× Evo M-MLV RT ReactionMix*1 4 μL，RNase freewater*1 6 μL；反应条件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。

1.2.4 RT-qPCR反应本试验使用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行RT-qPCR反应。反应体系包括TB Green Premix Ex TaqⅡ 10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μL，DNA模板（<100 ng）*2 2.0 μL，灭菌水6.4 μL。RT-qPCR反應条件：95℃预变性30s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；熔解，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min；50 ℃降温30 s。

1.3 统计分析

试验数据用2-ΔΔCT 算法进行计算，并采用SPSS 20.0软件进行差异显著性分析（α=0.05），使用Origin 2021软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 氮处理对不同高粱品种不同生育期NR基因相对表达量的影响

2.1.1 对叶片NR基因相对表达量的影响以N0处理作为对照，分别对辽粘3号和晋杂34在不同生育期不同氮处理的叶片NR基因相对表达量进行分析。结果表明，在拔节期、抽穗期、成熟期，辽粘3号叶片NR基因相对表达量均表现为N2>N3>N1>N0，N2处理下的叶片NR基因相对表达量显著高于其他处理；在苗期，N3处理的叶片NR基因相对表达量最高，N2处理次之。在苗期、抽穗期、成熟期，晋杂34在N2处理的叶片NR基因相对表达量最高，N3处理次之，其中苗期、成熟期N2处理显著高于其他处理。在拔节期，晋杂34叶片NR基因相对表达量随施氮量增加逐渐上调，N3处理下的叶片NR基因相对表达量分别是N0、N1、N2处理的10.24、2.60、1.26倍（图1）。

2.1.2 对籽粒NR基因相对表达量的影响以N0处理作为对照，分别对辽粘3号和晋杂34在不同生育期不同氮处理的籽粒NR基因相对表达量进行分析。结果表明，在抽穗期，辽粘3号和晋杂34籽粒NR基因相对表达量随施氮量增加呈上调趋势，N3处理显著高于其他处理。在成熟期，辽粘3号在N3处理的籽粒NR基因相对表达量显著高于其他处理，晋杂34在不同氮处理的籽粒NR基因相对表达量表现为N2>N3>N1>N0，且各处理之间没有显著差异（图2）。

2.2 氮处理对不同高粱品种不同生育期GS基因相对表达量的影响

2.2.1 对叶片GS基因相对表达量的影响以N0处理作为对照，分别对辽粘3号和晋杂34在不同生育期不同氮处理的叶片GS基因相对表达量进行分析。结果表明，在苗期、拔节期、抽穗期、成熟期，辽粘3号叶片GS基因相对表达量均表现为N2>N3>N1>N0，N2处理显著高于其他处理。在苗期、拔节期、抽穗期、成熟期，辽粘3号在N2处理的GS基因相对表达量分别是N0处理的3.73、4.55、2.91、1.73倍。在苗期、拔节期、抽穗期、成熟期，晋杂34叶片GS基因相对表达量随施氮量增加逐渐上调，且苗期、拔节期、抽穗期N3处理显著高于其他处理；成熟期N1、N2、N3处理间差异不显著（图3）。

2.2.2 对籽粒GS基因相对表达量的影响以N0处理作为对照，分别对辽粘3号和晋杂34在不同生育期不同氮处理的籽粒GS基因相对表达量进行分析。结果表明，在抽穗期，辽粘3号和晋杂34高粱籽粒GS基因相对表达量表现为N2>N3>N1>N0，N2处理显著高于其他处理。在成熟期，辽粘3号和晋杂34在N2处理的籽粒GS基因相对表达量最高，N0、N1、N3处理间差异不显著（图4）。

2.3 氮处理对不同高粱品种不同生育期GOGAT基因相对表达量的影响

2.3.1 对叶片GOGAT基因相对表达量的影响以N0处理作为对照，分别对辽粘3号和晋杂34在不同生育期不同氮处理的叶片GOGAT基因相对表达量进行分析。结果表明，辽粘3号在苗期、拔节期、抽穗期、成熟期N2处理的叶片GOGAT基因相对表达量显著高于其他处理，在苗期、拔节期、抽穗期、成熟期N3处理的叶片GOGAT基因相对表达量分别是N0处理的3.11、7.69、2.02、2.08倍。在苗期、抽穗期，晋杂34在N3处理的叶片GOGAT基因相对表达量最高，分别是N0处理的10.66、1.99倍；在拔节期、成熟期，晋杂34在N2处理的叶片GOGAT基因相对表达量最高，分别是N0处理的6.59、4.58倍（图5）。

2.3.2 对籽粒GOGAT基因相对表达量的影响以N0处理作为对照，分别对辽粘3号和晋杂34高粱在不同生育期不同氮处理的籽粒GOGAT基因相对表达量进行分析。结果表明，在抽穗期，辽粘3号和晋杂34高粱籽粒GOGAT基因相对表达量表现为N2>N3>N1>N0，N2处理的叶片GOGAT基因相对表达量分别是N0的2.97、3.98倍。在成熟期，辽粘3号和晋杂34高粱籽粒GOGAT基因相对表达量随施氮量增加逐渐上调，且N2、N3处理间差异不显著，N2处理的叶片GOGAT基因相对表达量是N0的12.89、4.38倍（图6）。

3 讨论

氮素同化过程受到基因的调控，氮素含量影响氮代谢相关基因的表达，不同基因在不同品种的氮代谢通路上发挥的作用也会有所差别［11-12］。硝态氮在NR等相关酶的催化下可以转化成铵态氮，GS/GOGAT可以催化铵态氮生成谷氨酸，在无机氮转化成有机氮过程中发挥重要作用。目前，NR基因已在菠菜［13］、桑樹［14］等多个植物中被克隆，GS基因也相继在甜菜［15］、小麦［16］中被克隆。影响氮代谢相关酶基因表达的因素很多，其中温度、光照、Fe3+均可以影响氮代谢相关酶基因的表达［17］。王添民研究发现，不同硝铵比可以影响葡萄NR、GS、GOGAT基因的表达量［18］。植物的不同部位氮代谢相关酶基因表达也有所差别，周月琴研究发现，NR基因在茶树根部的表达量要高于茎和叶［19］。

本研究通过测定高粱NR、GS、GOGAT基因相对表达量发现，除成熟期叶片外，其他各生育期辽粘3号和晋杂34叶片、籽粒在施氮条件下的NR、GS、GOGAT基因相对表达量均高于未施氮处理（N0）。同时，辽粘3号和晋杂34在N2、N3处理的NR、GS、GOGAT基因相对表达量高于N0、N1处理。在抽穗期、成熟期，辽粘3号和晋杂34在N2处理下的叶片NR基因相对表达量最高。随施氮量增加，各生育期辽粘3号叶片GS、GOGAT基因相对表达量呈先上调后下调的变化趋势，且N2处理显著高于其他处理；晋杂34叶片GS基因相对表达量逐渐上调。在抽穗期，辽粘3号和晋杂34籽粒GS、GOGAT基因相对表达量随施氮量增加呈先上调后下调的变化趋势，N2处理表达量最高。以上说明合理施氮可以提高高粱NR、GS、GOGAT基因相对表达量，氮素过多则会抑制氮代谢相关酶基因的表达。本研究结果与宁改星等的研究结果［7，20］保持一致。之前研究的施氮量对高粱氮代谢关键酶活性的影响发现，适当施氮可以提高辽粘3号高粱氮代谢相关酶活性，有利于氮代谢过程，从而提高产量［21］。本研究从分子角度进一步验证上述结果。

4 结论

综上所述，适当施氮可以提高高粱NR、GS、GOGAT基因相对表达量，促进植物氮代谢过程，同时N2、N3处理下的高粱氮代谢相关酶基因相对表达量较高，与氮代谢相关酶活性研究结果一致。综合氮素利用效率等多方面因素，可以将N2（120 kg/hm2）处理确定为辽粘3号、晋杂34高粱的最佳施氮量。

参考文献：

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