膜联蛋白A家族成员在乳腺癌中作用机制的研究进展

南 璐，郭梦杰，高雅楠，贾红燕

1.山西医科大学 第一临床医学院，山西 太原 030001；2.山西医科大学第一医院 乳腺科，山西 太原 030001

乳腺癌(breast cancer)是全球女性最常见的癌,目前已位居女性恶性肿瘤病死率之首,2022年2月,国家癌中心发布的最新一期的全国癌统计数据显示: 2020年中国女性新发癌病例数209万, 其中乳腺癌新发超越肺癌,登顶首位。尽管目前针对乳腺癌的手术、化学治疗、放射治疗、免疫治疗及靶向治疗等综合治疗已经相对成熟,但越来越多的患者在治疗后期会产生耐药性,因此,探索新的乳腺癌治疗策略刻不容缓。

膜联蛋白A(annexins A,ANX A)家族是受Ca2+调节的蛋白超家族,包括C端核心区域和N端可变区域,前者通过与膜相关磷脂结合发挥作用,后者则可区分不同家族的不同亚型。与一系列生物学活动密切相关,包括生物膜形成、胞吞胞吐,DNA合成等。研究发现ANX A家族参与乳腺癌细胞的侵袭转移、凋亡、耐药等。本文通过剖析ANX A家族在乳腺癌中扮演的角色,以期为乳腺癌的诊断和治疗提供新方向。

1 ANX A家族成员概述

高等脊椎动物的Annexins被归类为A家族,含12个成员,命名为ANX A1-ANX A13,其中ANX A12尚未被证实。在生物学中,ANX A蛋白家族是一组钙依赖性磷脂结合蛋白,当Ca2+存在时,其C端可结合到磷脂膜上并发生构象变化,并暴露出N端从而发挥生物学功能。除了Ca2+外,ANX A的N端也有多个结合位点,S100钙结合蛋白A10(S100A10)是一种钙依赖性的信号通路介导分子,S100-ANXA相互作用已被证明可以激活ANX A使其发挥作用。N端结构域是区分不同亚家族的主要依据,是该家族成员具有不同功能特性的结构基础。

2 ANX A家族各成员的结构和功能特点

ANX A家族均为可溶性蛋白,存在一些共同的结构和生物学功能。在结构上,其C端区域为保守的,除ANX A6由8个核心片段组成外,其余成员均为4个螺旋状重复单元,并在空间结构中折叠为盘状,可以以Ca+依赖的方式与磷脂结合。其共同参与有丝分裂、膜离子通道的形成、磷脂酶A2活性的抑制、出胞、入胞作用,并与多种恶性肿瘤的增殖、浸润及转移密切相关。其差别主要由N端结构域决定,根据N端序列的不同,表现出不同的功能特点,ANX A1通过其N端激酶特性磷酸化多种蛋白质残基,ANX A3通过丙氨酸取代经典的Trp-5,与磷脂具有很强的结合能力。同时,家族中的一些成员在特定组织中唯一表达,ANX A3诱导人脐静脉内皮细胞迁移和小管形成,ANX A4在耳蜗和前庭毛细胞中特异性表达[1],ANX A5则参与免疫T细胞的活化[2]。ANX A家族在癌细胞侵袭、转移及凋亡中的作用也已经得到证实。ANX A1主要调控肿瘤细胞骨骼重塑和免疫应答相关过程,从而影响癌细胞的侵袭性迁移[3]。ANX A2通过破坏细胞外基质的完整性,导致肿瘤侵袭和转移[4]。ANX A3通过磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B、细胞外信号调节激酶和低氧诱导因子-1信号通路等影响细胞增殖、迁移和凋亡。ANX A4通过激活NF-κB信号通路,促进细胞周期进程,抑制细胞凋亡[5]。有些成员还被证实可能与肿瘤耐药性相关,在正常情况下,紫杉醇诱导ANX A4向细胞质膜易位,促进肿瘤细胞凋亡。然而,ANX A4可以与肿瘤抑制基因Fhit蛋白的N端部分结合,形成ANX A4-Fhit复合物,特异性地阻止细胞质易位并产生耐药性[6]。含有ANX A6的外泌体的分泌以YAP1依赖的方式促进乳腺癌细胞的紫杉醇耐药[7]。

3 ANX A家族各成员在乳腺癌发生发展中的作用机制

3.1 ANX A1在乳腺癌发生发展中的作用机制

PRSS22是人丝氨酸蛋白酶中的一员,最初被证实为促进胃癌转移的新型癌基因,筛选PRSS22和ANX A1蛋白结合的乳腺癌细胞后发现PRSS22裂解ANX A1后可产生一个n端肽,该肽启动FPR2/ERK信号轴以增加乳腺癌的侵袭性[8]。USP7为程序性细胞死亡配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)的去泛素化酶,ANX A1衍生肽A11与USP7竞争结合和降解癌细胞中的PD-L1,通过抑制肿瘤免疫逃逸表现出明显的抗肿瘤作用[3]。ANX A1通过减少上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)标志物、波蛋白和肌球蛋白轻链激酶的表达也可以抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)DCST1-AS1通过ANX A1促进TGF-β诱导的EMT,并增强三阴性乳腺癌细胞的化疗耐药[9]。目前TNBC可分为6个亚型,大多数关于ANX A1的研究与TNBC中的间质干细胞型(mesenchymal stem-like,MSL)、基底样-1型(basal-like-1,BL-1)及基底样-2型(basal-like-2,BL-2)相关,这3种亚型约占TNBC的70%～80%,因此可以推断ANX A1与TNBC之间存在良好的关联。而未来的机制研究应侧重于ANX A1在未被充分代表的TNBC分子亚型中的作用,并使用更具有临床相关性的疾病模型。

3.2 ANX A2在乳腺癌发生发展中的作用机制

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)被认为是转移的前体细胞,是最终导致乳腺癌死亡的主要原因,Ral蛋白是Ras小G蛋白家族的成员,激活的RalA可以直接与下游效应物相互作用,Src家族激酶(Src family kinases,SFKs)是一类非受体型的蛋白酪氨酸激酶,Src为家族中的一员,可使ANX A2磷酸化,RalA-ANXA2-Src复合物通过激活ERK1/2信号在乳腺癌中促进CTC的形成,导致乳腺癌进展[10]。活化C激酶1(receptor for activated C kinase 1,Rack1)作为信号中枢,也可以介导Src激酶对ANX A2的磷酸化,在乳腺癌细胞耐药和侵袭/转移的潜能中发挥作用[11]。癌蛋白c-Myc的表达和定位在转录、mRNA转运、翻译以及蛋白稳定性水平上受到高度调控,胞质中磷酸化的ANX A2可以与c-Myc mRNA的3′非翻译区(untranslated region,UTR)的特定定位元件结合,导致其定位到核周区域[12],参与乳腺癌细胞凋亡。此外,S100钙结合蛋白A10(S100A10)是一种钙依赖性的信号通路介导分子,ANXA2/S100A10四聚体复合体 (AIIt)的发现,在恶性癌细胞和纤溶之间建起了桥梁[4]。该复合物是恶性及非恶性血管生成的关键因子,促进肿瘤细胞的侵袭和转移,因此了解其在乳腺癌中的作用,有望成为乳腺癌治疗的新靶点。

3.3 ANX A3在乳腺癌发生发展中的作用机制

ANXA3被认为是一种新的血管生成因子,与乳腺癌细胞的侵袭转移、凋亡及耐药有关,并且是乳腺癌的潜在治疗靶点。ANX A3主要通过NF-κB信号通路发挥作用,该通路在乳腺癌模型的EMT过程中起重要作用。在三阴性乳腺癌细胞系中发现在敲低ANX A3的癌细胞中存在EMT,其证据是间质标志物(vimentin和N-cadherin)减少,上皮标志物(E-cadherin和γ-cadherin)增加,而敲低NF-κB抑制蛋白IκBɑ可以部分逆转ANXA敲低诱导的EMT状态,证实ANX A3通过该信号通路影响乳腺癌细胞的侵袭和迁移[13]。ANX A3的异常表达也被证明可以通过下调多种促凋亡蛋白和细胞周期独立激酶(cyclin-dependent protein kinases,CDKs),从而促进细胞凋亡和细胞周期阻滞。在一项对乳腺癌细胞系的体外研究中发现,抑制ANX A3可显著降低细胞周期调节蛋白激酶4(CDK4)的表达,增强转录因子E2F1和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27Kip1的表达[14]。同时,ANX A3激活 NF-κB通路活性也被认为是影响乳腺癌细胞对阿霉素和多西紫杉醇耐药性的可能机制[13]。最新的一项研究表明,miR-221/222直接靶向ANX A3的3′-UTR,在mRNA和蛋白水平上抑制ANX A3的表达。与阿霉素联合,下调ANX A3可能使阿霉素诱导的细胞死亡致敏,诱导持续的G2/M和G0/G1骤停。通过增加miR-221/222的表达抑制ANX A3,可以提高化疗药物的有效性[15]。尽管有这些发现,但目前关于ANX A3在抗肿瘤抗生素和紫杉烷类药物耐药中作用的数据非常有限,表明该领域迫切需要进一步探索。

3.4 ANX A4在乳腺癌发生发展中的作用机制

STAT3信号在乳腺癌中经常被激活,ANX A4可以通过提高JAK1和p-STAT3的表达来激活JAK-STAT3信号通路,增强乳腺癌细胞的侵袭和转移,该作用被证实是与ANX A1共同介导的结果[16]。此外,上调ANX A4可增强其与NF-κB p50的相互作用,激活NF-κB信号通路,促进细胞周期进程,抑制细胞凋亡[5]。ANX A4还可以与肿瘤抑制基因Fhit蛋白的n端部分结合,形成ANX A4-Fhit复合物,特异性地阻止细胞质易位并产生耐药性,并且目前已经通过合成Fhit衍生物在亲和力测量方面进行了量化[6]。

3.5 ANX A5在乳腺癌发生发展中的作用机制

所有膜联蛋白家族的成员都有暴露于凋亡细胞表面的高度保守的核心结构域,并通过树突状细胞相关的C型凝集素-1(dectin-1)受体触发吞噬细胞中的耐受性信号转导。诱导细胞凋亡后所有表达的膜联蛋白均能转移到细胞表面,其中以ANX A1、ANX A2和ANX A5为主,并根据人类数据发现其在恶性组织中的表达与免疫浸润相关[17]。当细胞凋亡时,通常位于质膜内小叶中的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)会重新定位到外质膜,一旦外化,PS与其受体结合促进吞噬细胞对凋亡细胞的摄取。ANX A5与PS具有高亲和力,二者结合阻碍PS与免疫细胞的相互作用,目前已被用作检测细胞凋亡的标志物[18]。ANX A5可能通过与其他膜联蛋白家族成员的协同作用参与乳腺癌的侵袭转移和凋亡,尚未发现其在乳腺癌中产生耐药的机制,探究该复杂的生物活动过程,对于未来乳腺癌的早期诊断、治疗和预后方面有广泛的应用前景。

3.6 ANX A6在乳腺癌发生发展中的作用机制

ANX A6是所有保守膜联蛋白中最大的蛋白,主要存在于质膜和内体室中。ANX A6作为多功能支架蛋白,招募信号蛋白,调节胆固醇和膜转运,影响肌动蛋白动力学。ANX A6与许多癌相关的生物学过程有关,包括细胞侵袭转移、凋亡、耐药等。ANX A6通常被认为是肿瘤抑制基因,主要是因为ANX A6负调控表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及其下游MAPK和PI3K-Akt信号通路的磷酸化,这是肿瘤发生的两个重要信号,从而进一步抑制肿瘤的侵袭和转移[19]。而乳腺癌中ANX A6的表达是多功能的,其在基底样乳腺癌患者的肿瘤组织中低表达,但在浸润性乳腺癌表型中升高[20]。外泌体-ANX A6(ANX A6-exo)上调可提高敏感癌细胞的细胞活力和集落形成,抑制细胞凋亡[21]。ANX A6的耐药可由多种因素介导。TNBC细胞暴露于缺氧(>24 h)而不是短暂暴露(<24 h)可以刺激ANX A6的表达,并且缺氧诱导的ANX A6表达也可以增加TNBC细胞对EGFR和雄激素受体(androgen receptor,AR)拮抗剂的抗性[22]。YAP1是一种转录共激活因子,其活性受Hippo信号通路控制,ANX A6-exo通过上调YAP1促进Hippo通路的调控异常,并且通过沉默YAP1可以取消ANX A6-exo对乳腺癌细胞紫杉醇(PTX)耐药和癌细胞侵袭性的促进作用[7],其可能为ANX A6-exo促进乳腺癌进展和PTX耐药的潜在机制。各项研究表明ANX A6的检测可能不仅能作为特定乳腺癌亚型的潜在生物标志物,还有望对基底样TNBC对靶向治疗干预的反应进行预测。因此进一步研究ANX A6的上述特性并加以利用,对于作为描述乳腺癌的诊断及预后的生物标志物是有必要的。

3.7 ANX A家族其他成员在乳腺癌发生发展中的作用机制

大量临床前和临床研究表明,大多数ANX A具有明显的侵袭性和转移性。构建体外三维(3D)“乳腺导管原位癌(ductal carcinomainsitu,DCIS)样”无定形结构,发现受全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,ATRA)调控的miRNA可以靶向调节ANX A8 mRNA从而影响ATRA-全反式视黄酸受体α(retinoic acid receptor,RARA)-ANX A8,其失调可能导致DCIS的发生[23]。敲低AXNA7可促进乳腺癌细胞MCF-7凋亡[24],其可能由激素和/或神经递质介导。MicroRNAs(miRNAs)是细胞中一类短的内源性非编码RNA,主要功能是沉默靶mRNA。miRNA筛选分析发现miR-186-5p在人乳腺肿瘤中下调,过表达miR-186-5p可以调节Bcl-2和p53信号诱导细胞凋亡。ANXA9作为miR-186-5p的靶基因,提示miR-186-5p-ANX A9可能参与乳腺癌细胞凋亡的调控[25]。

4 问题与展望

ANX A蛋白家族众多成员中的大多数已被发现与乳腺癌有关,但目前国内外均尚未发现ANX A10-ANX A13在乳腺癌中的应用,并且许多相关研究方向仍集中于蛋白C端功能的研究,这些研究虽有一定意义,但由于蛋白C端功能较为一致,无法体现每个家族成员的独特分子特征及功能。此外,ANX A蛋白也与多药耐药密切相关,目前,大多数涉及ANX A蛋白的药物研究仍处于实验室阶段,只有少数临床应用。如何将这些发现应用于临床治疗是未来乳腺癌研究的挑战之一。未来的研究应侧重于ANX A蛋白家族N端功能的研究以及深入了解ANX A家族诱导化疗耐药的机制,评估ANX A家族作为诊断或预后生物标志物在更大患者队列中的临床意义,实现防癌与治癌相结合。