静电纺丝复合支架在骨组织工程中的应用

王 妮,程佳佳,高 丽

(1.遵义医科大学 口腔医学院,贵州 遵义 563099;2.遵义医科大学附属口腔医院 牙周病科,贵州 遵义 563099)

创伤、骨折、炎症、先天性疾病或肿瘤等导致的严重骨缺损,因超过机体的自愈能力而难以愈合,增加了骨折风险,这不仅损害了患者的身心健康,而且加重了医疗经济负担。有相关文献建议缺损长度大于2 cm或周径损失大于50%的骨缺损,需要采取移植手术来恢复或替代缺失骨组织的形态和功能[1]。自体骨移植因具有良好的组织相容性、成骨特性及非免疫原性成为骨缺损修复的金标准,但供区损伤、供区组织数量短缺、受区难以适应解剖结构及后期畸形的缺点制约了其临床应用[2]。骨组织工程是21世纪兴起的一门新兴的交叉学科,提出将种子细胞、生长因子和工程支架材料用于骨修复,为骨缺损的治疗提供了一种可替代的治疗方法。其中,支架材料作为替代物的物理基础,不仅提供了利于细胞附着、增殖和分化的适宜环境,还作为骨细胞外基质沉积的载体,在骨组织工程中起着关键作用[3]。

静电纺丝制备的纳米纤维具有仿生细胞外基质、高比表面积、高孔隙率等特性,有助于细胞黏附、迁移,有效促进细胞间的物质交换,而纳米技术能进一步提升支架在组织和器官再生方面的性能,纳米结构支架比宏观支架在组织和器官的再生方面更具优势[4]。近年来,静电纺丝纳米纤维支架因可规模化生产、低毒,以及可通过化学修饰灵活控制和微调支架的特性,而被研究应用于血管、肌肉、皮肤等组织工程的再生研究[5-7]。现从骨组织工程和静电纺丝技术的基本概念、静电纺丝改性及复合支架几个方面进行综述,以期为静电纺丝复合支架应用于骨缺损的修复提供理论依据。

1 骨组织工程

1.1 骨组织的生物学特点 骨组织是人体硬组织的主要构成部分,了解天然骨的生理学是成功开发骨修复支架材料的第一步。骨组织由松质骨和皮质骨构成:皮质骨主要位于骨组织的最外层,不含有机质,矿化度高,具有质量重、密度高、弹性模量高、抗压能力强等特点;松质骨主要位于骨组织内部,由众多小梁骨构成,质地较皮质骨软,具有质量轻、密度低、血管密度高、高度多孔性、弹性好韧性强及拉伸强度低的特点,可容纳血管、骨基质和其他有机成分,是营养物质和代谢产物运输的通道[8]。二者结合使骨组织成为一种独特的机械结构,能承载高水平的载荷及抗变形的能力。骨ECM的无机成分主要是羟基磷灰石晶体,约占60%;其余40%是有机基质,包括Ⅰ型胶原蛋白,糖蛋白、蛋白聚糖和非胶原蛋白、水等[9]。

1.2 骨组织形成的机制 在胚胎发育过程中,骨组织有两种不同的成骨模式,即软骨内骨化和膜内骨化,两种成骨模式均可通过间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分泌细胞外基质(ECM),从而调节炎症反应,刺激组织再生;MSCs在骨再生过程中受微环境、细胞间通信、物理因素和细胞结构的影响,可分化为成骨、成软骨、成脂和骨髓基质细胞谱系。软骨内骨化是指多能MSCs聚集、增殖、先分化为软骨细胞分泌ECM形成软骨组织,继而分化为肥大软骨细胞,经成骨细胞祖细胞、破骨细胞和血管吞噬吸收并被骨髓取代,形成原发性和继发性骨化中心;随后分化为成骨细胞,分泌一系列ECM蛋白(骨钙素、碱性磷酸酶和类骨质),最后类骨基质层和外部钙化外壳包裹成骨细胞,形成骨细胞,四肢及肋骨的发育和生长属于软骨内骨化[10]。而膜内骨化则是不形成软骨中间层,MSCs直接分化为成骨细胞[11]。

机体骨组织在出生后为适应机械环境的变化不断改建和重塑,骨的重塑对于骨骼保持结构完整性和适应机械应力变化至关重要。骨缺损愈合的生理过程中涉及成骨细胞、骨细胞、破骨细胞和骨衬里细胞的协同作用,调节旧骨组织吸收和新骨组织的形成。在骨折、肿瘤或感染导致的骨缺损部位,成骨细胞负责合成、钙化形成新骨,是参与新骨形成的主要细胞[8]。

1.3 骨组织工程 骨组织工程(bone tissue engineering,BTE)是建立具有高孔隙率和可控孔径大小的三维支架,可将种子细胞植入其中或利用内源性干细胞的分化潜能,从而促进骨组织再生。近年来,随着材料和制造工艺的进步,BTE逐渐成为治疗临界骨缺损(critical size bone defect,CSBD)的一种非常可行的方法,不仅可以修复受损的骨骼,还可以克服当前临床治疗的局限性,如自体骨、同种异体骨的缺如等。骨生物支架材料的构建是BTE的难点,目前关于骨生物支架的研究方兴未艾。在支架的设计上应考虑到以下几点:(1)生物安全性:其本身或降解产物对机体应是安全无毒害的。(2)生物相容性:利于细胞黏附和增殖。(3)生物降解性:可程序化替代骨样沉积的支架材料。(4)3D多孔结构:利于细胞渗透,物质交换以及血管生成所需合适的孔隙率和孔径结构。(5)无菌性且不丧失生物活性。(6)可控性释放生物活性分子或药物。(7)机械性能:骨改建过程中能承受外部载荷和应力,由降解引起的机械性能变化都应保持与愈合或再生过程的相容性[12]。

2 静电纺丝

2.1 静电纺丝 静电纺丝是一种最普遍、便捷、经济实惠的制造纳米纤维支架的方法[13]。静电纺丝是利用高压电源克服聚合物溶液的粘性,从液体表面喷出带电液体射流的技术。该技术的基本原理是高压电源对注射器针头的溶液施加静电力,当静电力超过液体表面张力时,旋转的液滴在针头尖端变形,形成“泰勒锥”。当作用力超过锥形液滴表面张力的临界值时,形成射流,同时,纺丝液中的溶剂挥发,直径从几十纳米到几微米(取决于聚合物溶液和静电纺丝参数)的连续聚合物纤维沉积在集电极上[14]。静电纺丝制备的纳米纤维支架具有应用于骨组织再生的突出优势,其在结构上类似于天然骨ECM中发现的分层组织微/纳米级纤维结构,其多孔结构及高比表面积可负载种子细胞和生物活性分子可以促进细胞黏附、增殖和分化,且生产过程中可以控制纤维直径、纤维取向、孔隙率等特性从而改善支架的性质[15]。

2.2 静电纺丝基质 近年来,静电纺丝制备的可生物降解聚合物支架可以避免二次手术,在骨组织再生医学领域受到特别关注,根据其材料来源分为天然聚合物和合成聚合物。天然聚合物根据其组成分为蛋白质类材料(如胶原、明胶和丝素蛋白)和多糖类材料(如纤维素、壳聚糖),大多数天然聚合物具有良好的生物相容性有助于细胞黏附及增殖[16]。但天然聚合物制备的静电纺丝支架存在机械性能、生物降解性难以控制的缺点,无法为成骨细胞提供足够的结构支持和保护。此外,部分天然聚合物易受材料性质限制。例如,透明质酸因其优异的生物相容性、生物黏附性和低免疫原性等生物学特性而备受关注,但其机械强度相对较低,并且作为聚电解质还具有大量的自由电荷载流,该特性使得纯透明质酸难以被纺丝成膜[17]。具有优良力学性能和纺丝能力强的合成聚合物,如聚乳酸(polylactic acid, PLA),聚乙醇酸(polyglycolic acid, PGA)和聚己内酯(polycaprolactone, PCL)及其共聚物组成等,其可以通过改变材料的单体单位、反应条件、共聚物的比例和浓度来控制和调整合成聚合物的力学特性、降解速率、可加工性、混溶性等性质,具有可预测和复制的机械和物理性能;其制备的静电纺丝支架在大多情况下不表现出毒性作用,但其表面的性质(例如形貌、亲水性、电荷)不能促进细胞黏附、增殖和分化;并且缺乏天然ECM的生物活性,表现为体内排斥率增加,骨再生能力低[18-19]。有研究报道,PCL具有优异的机械性能满足许多骨科应用的机械需求,然而,由于其高度疏水性和细胞识别位点的缺失导致细胞黏附性差,这导致支架的骨传导性差[20]。

3 静电纺丝的改性方法

近年来,静电纺丝技术因为能够使可生物降解聚合物支架满足特定组织再生所需要求,并赋予支架生物活性功能,逐渐成为骨组织支架材料的研究热点。而单一聚合物制备的支架通常不能达到理想的骨再生效果,通常需要采用生物活性物质、药物、无机生物材料等对其表面和结构进行进一步修饰以改善其生物功能可将聚合物转化为具有生物活性功能的仿生支架。

3.1 生物活性分子 生物活性分子是构成组织工程(tissue engineering, TE)的三大支柱之一,能显著影响支架特性和细胞行为。从组织工程的角度来看,生物活性分子是改善支架特性、影响细胞活性的生物因子或信号,从而促进目标组织更好、更密集的再生。因此,生物活性分子主要通过增加细胞黏附、增殖和分化来提高静电纺丝支架生物相容性[21]。

3.1.1 细胞来源细胞外基质 细胞来源的细胞外基质包含复杂且有组织的大分子混合物,可以模仿天然细胞微环境来维持细胞表型及功能,可通过选择用于生成ECM的细胞类型、培养系统、应用外部刺激调节产生ECM,以及对源细胞进行遗传修饰以增强或沉默靶分子表达的能力来定制表面的细胞行为[22]。细胞来源的ECM富含胶原蛋白、基质大分子和生长因子,具有良好的生物相容性和生物降解性,有利于MSCs的增殖和成骨分化。用ECM改性的聚合物支架可以在材料和组织之间的界面上呈递ECM分子来促进干细胞成骨分化。如Carvalho等[23]研究了负载人间充质干细胞(HMSCs),人脐静脉内皮细胞(HUVECs)来源的ECM的PCL静电纺丝支架对MSCs成骨分化的作用,实验结果表明,两种细胞来源的ECM的PCL静电纺丝支架具有相似的物理/机械特性,都促进了细胞增殖,并且当支架同时负载两种ECM时的微结构更接近天然骨微环境而能够刺激MSCs的Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor, Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨钙素(osteocalcin, OCN)等成骨标志物的表达更高,更有利于细胞成骨分化,表现出更加优异的成骨潜能。

3.1.2 富血小板纤维蛋白 富血小板纤维蛋白(platelet rich fibrin, PRF)是第二代血小板浓缩物,已被证明可以促进成骨细胞的增殖和Runx2、ALP、OCN等成骨基因的表达,在骨形成中具有重要作用[24]。然而其单独用于骨再生时,其成骨能力有限。Rastegar等[25]用同轴静电纺丝的方法制备了含富血小板纤维蛋白的PCL/壳聚糖(PCL/CS-PRF)核壳纳米纤维支架,PRF的掺入增加了纯PCL/CS的机械性能、亲水性、孔隙率等,并且PRF还能缓慢且持续的释放影响HMSCs的成骨分化,含PRF的支架上ALP活性值和钙沉积量显著高于纯支架组,PCL/CS-PRF核壳支架可以为骨组织工程应用提供具有改善成骨作用的坚固结构。

3.1.3 透明质酸 透明质酸(hyaluronic acid, HA)是一种线性糖胺聚糖聚合物,存在于脊椎动物组织的细胞外基质中,包括结缔组织、上皮组织和神经组织;参与多种生物学过程,如胚胎发育、伤口愈合、癌症进展、血管生成、炎症和骨再生[26]。研究发现,透明质酸可调节细胞粘附、增殖和分化等重要细胞过程[27]。因此透明质酸通常与另一种聚合物结合,以制备静电纺丝支架。如Rachmiel[28]等使用静电纺丝技术制备了一种由PCL聚合物和HA组成的核/壳形态的复合支架,并结合了自组装短肽,该肽包含精氨酸——甘氨酸——天冬氨酸(RGD)基序,将HA和RGD序列的良好生物相容性和细胞附着特性赋予到PCL基支架中,且合成的纤维支架在形态上类似于骨ECM的纤维状结构,体外实验也表明了HA和RGD的添加确实提高了PCL支架的生物相容性,且MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性及钙化物沉积显著增加也表明该支架能促进成骨分化。

3.1.4 成纤维细胞生长因子-2 组织工程化引导组织再生膜不可避免的缺点是种子细胞在体外扩增过程中容易丧失分化能力。添加适量的生长因子在支架中是一种维持种子细胞分化能力的重要的方法,可以有效促进骨修复。成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor 2, FGF-2)是1种众所周知的促进血管生成的生长因子,有研究证明了 FGF-2能促进体内牙周骨组织生成[29]。Zhang 等[30]采用静电纺丝法制备的负载FGF-2的水性聚氨酯(WPU)纤维支架。结果证实,通过控制支架降解及力学性能,实现了生长因子的持续释放,血管生成相关因子的免疫组化结果表达呈阳性,表明负载在纤维中的FGF-2可显著促进细胞血管形成,负载FGF-2的纤维支架具有作为功能性GBR膜的潜力,以促进牙周修复过程中骨外血管的形成。

3.2 药物 静电纺丝可作为药物运输载体,通过在靶点位控制和优先释放药物来提高其生物利用度和功效,并增强其稳定性和溶解度[14]。静电纺丝可输送具有成骨功能的药物到骨缺损区,以最大程度发挥成骨效应,且部分药物还能发挥抗炎抗菌等多种功效。

3.2.1 米诺环素 米诺环素(minocycline, MINO)是对抗大多数牙周炎致病菌最常用的广谱抗生素之一。除了抗菌活性外,MINO还可以抑制骨吸收并促进骨形成。Ma等[31]制备负载MINO的PLGA静电纺丝膜,体外实验研究表明含有2%药物的MINO-PLGA膜更有利于成骨细胞增殖和粘附,随后的体内实验性牙周炎模型的研究结果也表明.MINO-PLGA膜增加牙周炎模型的牙槽嵴高度,抑制核因子-κB受体激活物(RANKL)配体的表达,促进骨保护素的表达,具有促进牙周炎患者的骨再生的潜力。

3.2.2 糖皮质激素 地塞米松 (dexamethasone, DEX) 是一种合成糖皮质激素,已被用于诱导骨髓干细胞 (BMSC) 的成骨分化,然而,高浓度的DEX可以抑制成骨细胞的增殖,甚至诱发毒副作用[32]。骨组织工程的一种常用方法将分化因子如抗坏血酸和DEX添加在静电纺丝上,从而增加维持干细胞在体外分化时间。DEX是一种合成的糖皮质激素,在骨分化中也扮演着重要角色,如果将 DEX从培养物中完全去除,HMSCs 则不会发生分化。Omidvar等[33]研究用壳聚糖微球(CSM)封装Dex,将其嵌入到PCL支架中,形成PCL/CSMs-Dex复合支架,由于其核壳结构,致使Dex 能在 14 d内持续释放,不会出现明显的突发释放,可以延长释放时间并消除初始爆发;在CSMs存在下,PCL支架的水接触角从141.4 ± 3.8减小到118.4 ± 7.6, PCL的亲水性明显提高,hMSC在PCL/CSMs-Dex支架上的增殖也有所改善。此外,成骨测定显示碱性磷酸酶活性和矿物质沉积物增加,骨特异性基因的表达也有所增加。

3.2.3 辛伐他汀 辛伐他汀(simvastatin,SIM)是一种降胆固醇药物,可通过增加成骨细胞样细胞和干细胞中BMP-2、ALP、骨钙素和COL1mRNA的表达来支持成骨细胞分化并促进新骨形成,同时增加血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促进血管生成[34]。在引导骨组织再生(GBR)中,理想的屏障膜应由两个表面组成:面向骨缺损的多孔表面用于引导骨形成,面向软组织的致密表面用以防止非成骨细胞(如成纤维细胞)干扰骨愈合。传统采用共混的静电纺丝方法缺点一是暴露于有机溶剂的生物活性分子在静电纺丝过程中容易变性,二是缺乏持续缓释能力。Yu 等[35]用同轴静电纺丝的方法制备了一种新型的具有致密层及多孔层PCL-明胶/PCL-辛伐他汀屏障膜,将骨髓间充质干细胞(BMMSCs)和人包皮成纤维细胞(HFFs-1)分别接种在多孔层和致密层表面,共聚焦图像显示致密层有效的阻止了成纤维细胞的浸润,从药物释放曲线也证明了同轴静电纺丝实现了可控的药物持续缓释,且7 d时Cbf-α1及ALP成骨基因表达也显著提高,主要是通过提高膜的屏障功能及辛伐他汀的释放促进骨再生。

3.3 无机生物材料 无机生物材料具有特殊的成分、微观结构和长期可重复性,已被建议用于修复或替代肌肉骨骼系统和牙周异常的病变和受损部分[36]。无机生物材料因其生物相容性、骨传导性和生物可吸收性而得到认可,可用于改善聚合物静电纺丝支架表面拓扑结构、机械性能及生物相容性等。

3.3.1 生物陶瓷 羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)属于无机生物陶瓷材料,其化学成分和晶体结构与天然骨矿物质相似,具有生物活性、骨传导性和可生物降解性,已被广泛用作人工骨替代物。然而,由于脆性大,断裂韧性不足等缺点,纯HA支架的使用受到限制[37]。而与聚合物形成复合支架能获得更优良的生物性能及机械性能,如de Siqueira等[38]通过静电纺丝法以聚L -乳酸(PLLA)/聚己内酯(PCL)纤维为基材,结合电喷涂羟基磷灰石(HA),开发了定向和非定向排列的组织工程支架。研究发现在PLLA/PCL/HA支架中,HA的引入显著提高了这种材料的机械强度。此外,将成骨细胞(MC3T3-E1)与支架共培养后发现,添加HA的两种纤维支架都能够促进成骨细胞黏附和增殖,并且纤维定向排列的支架诱导细胞代谢活性增加。

3.3.2 二氧化硅 二氧化硅(SiO2)由于骨诱导活性而被选为骨形成的诱导因子,它不仅能改善成骨细胞的功能、抑制破骨细胞的功能,而且能在早期沉淀磷酸钙从而促进矿化。近年来研究者们也开发了SiO2改性的成骨复合材料,如Ge等[39]基于PCL/CS基础上制备了一种内嵌SiO2纳米颗粒的互相连续纤维的静电纺丝支架(PCL/CS/SiO2),结果表明SiO2的存在让PCL/CS/SiO2生物支架具有更好的亲水性,并提供了更多的细胞黏附位点;且成骨相关基因RUNX2、OCN和 COL1蛋白表达升高。将SiO2引入生物聚合物纳米纤维中,有利于细胞附着,促进细胞增殖,促进新骨形成,增强机体成骨能力。

3.3.3 氧化石墨烯 氧化石墨烯(GO)可以增强和支持MSCs的黏附、增殖,并且研究表明氧化石墨烯结构中的疏水π结构域通过疏水和静电作用改善了其与蛋白质的相互作用,从而诱导干细胞向成骨细胞分化[40]。Marrella 等[41]制备了负载用抗坏血酸还原的氧化石墨烯(RGO)或氧化石墨烯(GO)的PCL静电纺丝膜,以再现骨ECM的纤维结构,并评估了RGO掺入对纳米复合材料网的结构特性、生物力学和生物活性的影响。结果表明,RGO/PCL纤维支架显示出优越的机械性能(即杨氏模量和极限拉伸强度),其粗糙表面促进了成骨生长因子在其表面的吸附,显著促进了细胞黏附、扩散、增殖和矿化,从而改善了骨组织再生过程中的矿化。

4 多相复合支架

骨再生是一个复杂和漫长的过程,涉及大量的生长因子和激素协同调控,并且支架植入体内后面临细菌定植和耐药性。通过设计将多种改性剂共同加载到支架中被认为是促进骨组织再生的有效途径,其组合制备的静电纺丝支架不仅具有可定制的物理特性和可预测的机械性能,还优化了支架的生物相容性、促干细胞分化能力、抗菌性等,能更好地模拟细胞外基质的结构和组成,从而提高骨生物支架材料的临床应用价值。

HA和SIM的联合应用可序列调控成骨过程,Rezk等[42]制造了负载有SIM的PCL-聚癸二酸甘油酯(PGS)-HA纳米纤维;体外细胞培养试验表明,将HA纳米颗粒和SIM掺入复合纳米纤维中可改善成骨细胞的黏附和增殖,HA纳米颗粒为晚期成骨分化和生物矿化提供了适宜的环境,而SIM支持前成骨细胞初始附着和增殖,纳米纤维具有很强的骨再生能力。

聚乳酸-乙醇酸[poly(lactic acid-co-glycolic acid), PLGA]具有良好的生物相容性,但PLGA在受到紫外线照射、液体介质浸泡、热处理和环氧乙烷气体等物理或化学因素的刺激下会迅速收缩和变形,而胶原蛋白的引入改善了这些缺点。Jin等[43]用鱼胶原蛋白来修饰同轴纤维的PLGA壳层(PFC),并将黄芩苷(baicalin, BA)加载到PCL核心层(PCL-BA),该支架促进了骨间充质干细胞的成骨分化,刺激巨噬细胞极化为促修复表型。此外,体内研究表明,PFC / PCL-BA支架可以调节炎症和破骨细胞分化,有利于新生血管形成和骨形成。

为了克服当前复合支架材料在成骨和抗菌性能方面的局限性,Qian等[44]利用聚多巴胺(PDA)作为介质将银(Ag)/胶原蛋白涂覆PLGA/PCL支架(PP-PDA-Ag-COL),PP-pDA-Ag-COL支架上MC3T3增殖速率更高并且显著增强了MC3T3细胞黏附。在PP-pDA-Ag-COL支架上培养7 d和14 d的MC3T3细胞的ALP活性,BMP2和RUNX2成骨基因表达水平更高,PP-pDA-Ag-COL和PP-pDA-Ag支架具有更宽的抗菌区,该支架是具有持续抗菌特性和促进成骨分化的新型仿生材料。

5 展望

目前,用生物活性分子、药物及无机生物材料改性静电纺丝,能够改善支架的亲水性及生物活性,有利于间充质干细胞的黏附、增殖、分化及矿化,促进骨生成。静电纺丝制备的纳米纤维支架是一种合适的载体并且还能实现持续缓释的性能,避免了功能性分子在局部爆发性释放的缺点。此外,由于某些生物活性分子难以储存且在体外难以维持其长效的生物活性,故未来可以采用其他如微球、脂质体和介孔二氧化硅纳米颗粒等载体运输活性分子,与静电纺丝联合最大程度提高骨的生成。