ATP5J通过TOMM20调节线粒体功能并促进人肝细胞癌细胞转移*

冷君志， 王根旺， 刘 迪， 柳科军， 王 琦， 惠永峰

（宁夏医科大学总医院肝胆外科，宁夏 银川 750004）

肝细胞癌是一种常见的原发性肝癌，是全球第六大常见肿瘤。现阶段，如何寻找特异性和敏感性的基因，已经成为研究的关键。肝癌的发生涉及多基因相互作用，尤其是负责线粒体能量代谢过程中的线粒体合酶相关蛋白［1］。在众多线粒体合酶蛋白中，ATP 合成酶H+转运线粒体F0 复合体亚基F6（ATP synthase mitochondrial F0 complex H+trans‐porting， subunit F6， ATP5J）是F1F0-ATP 合酶的脂溶性成分F0的一个亚基，主要供线粒体内能量转化传导信息［2］。ATP 合酶相关蛋白在肿瘤能量代谢过程中发挥着关键作用，ATP5J是催化线粒体ATP 合成的关键基因。在胃癌研究中，富集于线粒体氧化呼吸链的ATP5J 蛋白表达显著上调，影响细胞线粒体的氧化磷酸化功能［3］。有文献报道，ATP5J在结肠癌组织中显著高表达，且与5-氟尿嘧啶耐药有关［4］。线粒体外膜转位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20， TOMM20）负责识别和运输前体蛋白，在多种肿瘤中高表达，可作为靶向线粒体的关键蛋白［5］。研究表明，TOMM20过表达增强结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的生物学行为，而降低TOMM20表达显著抑制结直肠癌细胞的生物学行为［6］。然而，ATP5J 在肝癌细胞能量转化中的作用以及与TOMM20 在肝癌细胞中的作用关系尚不明确。基于此，本项工作旨在阐明ATP5J 在肝癌细胞能量转化中的作用，以及是否通过TOMM20 影响肝癌细胞转移，从而为肝癌靶向治疗的进一步研究提供参考。

材料和方法

1 细胞系

人肝癌细胞株（Li-7；目录号：SCSP-5062）购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（https：//www.cellbank.org.cn/），所有细胞都在含有10%的胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM 培养液（Gib‐co）中，并放置于含5% CO2的恒温培养箱中培养。

2 主要试剂

培养细胞用的胎牛血清、1%青霉素/链霉素、DMEM 培养液购自Gibco；ATP5J 抗体（货号：14114-1-AP）、TOMM20 抗体（货号：11802-1-AP）和β-actin抗体（货号：20536-1-AP）均购自Proteintech；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（货号：ZB-2301）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1；货号： M8650） 购自北京索莱宝科技有限公司；pCMV-Mito-AT1.03（线粒体 ATP 荧光探针）检测试剂盒（货号：D2606）、Actin-Tracker Green-488 （微丝绿色荧光探针）检测试剂盒（货号：C2201S）和活性氧检测试剂盒（货号：S0033S）、Li‐po8000™转染试剂（货号： C0533）均购自上海碧云天生物技术有限公司；Transwell 细胞培养小室购自Corning；ATP5J 过表达质粒［ID：498；克隆载体：pcD‐NA3.1（+）］购自上海生工生物工程股份有限公司。

3 方法

3.1ATP5J过表达质粒、小干扰序列模型的构建和实验分组 取生长状态良好的Li-7 细胞以每孔3×105个接种于6 孔板，随机分为4 组，siRNA 阴性对照（siRNA-NC）组，过表达（overexpression，OE）空载体阴性对照（OE-NC）组，ATP5J过表达（ATP5J-OE）组和ATP5J小干扰RNA（ATP5J-siRNA）组。将ATP5J全长克隆到pcDNA3.1载体上，空载体（OE-NC）作为对照；构建三条干扰序列，筛选最佳转染效果的序列作为实验序列（ATP5J-siRNA：Sense：5´-GAGGACCU‐GUUGAUGCUAGUUTT-3´；Antisense：5´-AACUAG‐CAUCAACAGGUCCUCTT-3´。SiRNA-NC：Sense：5´-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3´； Antisense： 5´-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3´）。按照上海碧云天生物技术有限公司的转染说明，将细胞在37 ℃和5% CO2下培养，细胞融合度达到80%时，使用Lipo8000 转染试剂将过表达质粒和siRNA 序列转染到细胞中，培养48 h后收集细胞，提取蛋白进行验证转染效果，实验重复3次。

3.2 线粒体膜电位实验 各组完成相应干预后，加入1 mL 细胞培养液和1 mL 提前配制好的JC-1 染色工作液，并于细胞培养箱中在37 ℃下孵育20 min。孵育结束后，吸出上清，用配制好的JC-1染色缓冲液（1×）洗涤细胞 2 次，根据试剂盒说明，CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。将试剂盒中的CCCP 按照1∶1 000 加入到细胞培养液中，稀释至10µmol/L，处理细胞20 min。最后在荧光显微镜下观察，使用Image J 软件对图像进行分析，实验重复3遍，进行统计［7］。

3.3 线粒体ATP 荧光探针实验 将Li-7 细胞接种于6 孔板，在37 ℃和5% CO2下培养，当细胞融合度达到80% 时，根据Lipo8000 说明书将pCMV-Mi‐toAT1.03 质粒转染到各组细胞，并用荧光显微镜观察、拍照，通过Image J 软件对图像进行分析［8］，实验重复3遍，进行统计。

3.4 微丝绿色荧光探针实验 根据Actin-Tracker Green-488 试剂盒说明书对Li-7 细胞进行微丝荧光成像，将细胞用4%甲醛溶液在室温下固定20 min，用0.1% Triton X-100 的PBS 洗涤细胞3 次，每次5 min， 然后使用Actin-Tracker Green 染色试剂在37 ℃下避光孵育60 min，最后用DAPI对细胞核复染5 min（蓝色）。在荧光显微镜下观察并拍照记录，实验重复3遍，进行统计［9］。

3.5 Transwell 实验 将Li-7 细胞无血清饥饿24 h，制备细胞悬液。取细胞悬液200 µL 加入预铺Matri‐gel 的Transwell 小室中。在24 孔板的下室中加入600 µL 的完全培养液，在37 ℃、5% CO2常规培养48 h。取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用4%多聚甲醛溶液固定10 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗2 遍，用棉签擦去上室内的细胞。随机取中央及四周5 个视野，倒置显微镜观察随机拍照、计数和统计，实验重复3遍［10］。

3.6 Western blot实验 使用RIPA 裂解缓冲液将细胞在冰上裂解20 min，用BCA 检测试剂盒提取蛋白浓度，经SDS-PAGE 分离后转移到PVDF 膜上。用5%的脱脂奶粉溶液在室温下阻断2 h，加入对应的Ⅰ抗在4 ℃下过夜，所用Ⅰ抗为ATP5J（1∶1 000）、TOMM20（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）。之后再用TBST洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗IgG（1∶5 000）孵育1 h，采用ELC 发光液，β-actin 作为内参照，采用ImageJ 软件进行条带分析［11］，实验重复3遍。

3.7 细胞内活性氧（reactive oxygen species， ROS）检测 用2´，7´-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）来评估细胞内ROS 水平。按照1∶1 000 的比例用无血清培养液稀释DCFH-DA，使最终浓度为10 µmol/L，将各组细胞与DCFH-DA 工作液在37 ℃下孵育20 min［12］，仅在阳性对照孔中加入Rosup 作为阳性对照。使用荧光显微镜观察荧光强度，随机拍照，实验重复3遍。

4 统计学处理

使用SPSS 23.0进行数据分析，计量数据采用均值±标准差（mean±SD）表示，柱状图采用GraphPad Prism 8.0 软件制作，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 构建和验证ATP5J过表达、siRNA序列转染效果及ATP5J 对肝癌细胞线粒体膜电位水平、线粒体ATP产生的影响

本实验合成三条ATP5J-siRNA（ATP5J-siRNA1、ATP5J-siRNA2 和ATP5J-siRNA3）序列进行转染，显示ATP5J-siRNA3 转染效果较为显著（P<0.01），后续作为实验序列，见图1A。过表达质粒亦能显著增加ATP5J蛋白的表达（P<0.01），转染效果见图1B。

Figure 1． Verification of ATP5J overexpression and knockdown efficiency using Western blot. A： the protein level of ATP5J was de‐tected by Western blot after knockdown of ATP5J； B： the protein level of ATP5J was detected by Western blot after ATP5J overexpression. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs OE-NC； ##P<0.01 vs siRNA-NC.图1 应用Western blot验证ATP5J过表达、敲减转染的效果

线粒体ATP 荧光探针实验结果显示，与OE-NC组相比，过表达ATP5J 显著上调线粒体ATP 荧光强度（P<0.01），而敲减ATP5J与之相反（P<0.01），见图2A。线粒体膜电位实验结果显示，与OE-NC 组相比，过表达ATP5J显著上调线粒体膜电位水平（P<0.01），敲减ATP5J后，线粒体膜电位水平显著降低（P<0.01），见图2B。

Figure 2. Effects of ATP5J on mitochondrial membrane potential and mitochondrial ATP fluorescence intensity in hepatoma carcino‐ma cells. A： compared with OE-NC group， the fluorescence intensity of ATP in ATP5J-OE group was significantly in‐creased； ATP5J siRNA significantly decreased the fluorescence intensity compared with siRNA-NC group， scale bar=20µm. B： compared with OE-NC group， the red fluorescence intensity in ATP5J-OE group was significantly increased；ATP5J siRNA significantly decreased the red fluorescence intensity compared with siRNA-NC group， scale bar=20 µm.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs OE-NC； ##P<0.01 vs siRNA-NC； △△P<0.01 vs positive control.图2 ATP5J对肝癌细胞线粒体ATP荧光强度、线粒体膜电位水平的影响

2 ATP5J调节肝癌细胞ROS生成，并重塑细胞骨架

活性氧检测结果显示，与OE-NC组相比，过表达ATP5J可下调ROS 生成（P<0.01）；相比较于siRNANC 组，敲减ATP5J后，ROS 水平显著升高（P<0.01），见图3A。微丝绿色荧光探针检测显示，过表达ATP5J可促进肌动蛋白丝排布及空间构象重塑，驱动细胞膜前端形成突起（P<0.01）；敲减ATP5J可抑制肌动蛋白丝的重塑和细胞膜前端突起（P<0.01）。见图3B。

Figure 3．ATP5J regulates ROS production and remodels the cytoskeleton in hepatoma carcinoma cells. A：compared with OE-NC group， the intensity of fluorescence in ATP5J-OE group was significantly decreased； ATP5J siRNA significantly increased the fluorescence intensity compared with siRNA-NC group， scale bar=20 µm. B： compared with OE-NC group， fluores‐cence intensity of microfilaments in ATP5J-OE group was significantly increased； ATP5J siRNA significantly decreased the fluorescence intensity of microfilaments compared with siRNA-NC group， scale bar=20 µm. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs OE-NC； ##P<0.01 vs siRNA-NC； △△P<0.01 vs Rosup.图3 ATP5J调节肝癌细胞ROS生成，并重塑细胞骨架

3 ATP5J 可调节肝癌细胞的侵袭能力，并调节TOMM20表达影响肝癌细胞线粒体功能

Transwell 实验结果显示，过表达ATP5J显著促进Li-7 细胞的侵袭能力（P<0.01）。敲减ATP5J后，肝癌细胞侵袭能力减弱（P<0.01）。见图4A。

Figure 4. ATP5J regulates the ability of invasion and the expression of TOMM20 in hepatoma carcinoma cells. A： compared with OENC group， the numbers of invasion cells in ATP5J-OE group were significantly increased， ATP5J siRNA significantly de‐creased the numbers of invasion cells compared with siRNA-NC group， scale bar=50 µm. B： compared with OE-NC group，Western blot results showed that TOMM20 protein expression in ATP5J-OE group was increased； ATP5J siRNA signifi‐cantly decreased TOMM20 protein expression compared with siRNA-NC group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs OE-NC； ##P<0.01 vs siRNA-NC.图4 ATP5J可调节肝癌细胞的侵袭能力，并调节TOMM20表达

Western blot 实验结果显示，过表达ATP5J后TOMM20 的表达增多（P<0.01），敲减ATP5J可显著降低TOMM20蛋白的表达水平（P<0.01），见图4B。

讨 论

在肝癌发展过程中，低效的诊断策略和有限的治疗靶点是临床医生面临的主要困难。随着研究的深入，观察到线粒体能量代谢相关蛋白影响着肝癌的进展。线粒体ATP 合酶的异常表达在肿瘤能量代谢过程中起着重要作用［13］。本研究旨在探索线粒体ATP 合酶ATP5J 通过TOMM20 调节线粒体膜电位水平和线粒体ATP 产生介导细胞骨架重塑影响肝癌细胞转移的作用机制。

有研究表明，结直肠癌细胞中ATP5J 表达上调可增强细胞迁移和5-氟尿嘧啶耐药性，下调ATP5J可逆转这一反应［2］。胃癌研究中，胃癌组织与癌旁组织相比差异显著的基因（包括ATP5J等）主要富集于线粒体氧化呼吸链，线粒体膜电位水平高低介导胃癌细胞ROS 的生成，两者相互作用影响细胞凋亡的发生［3］。研究显示，通过调节ROS 水平可影响肺癌细胞的转移能力［14］。本实验观察到ATP5J 可影响肝癌细胞ROS 的产生，此结果与上述的研究结果相似，这为了解ATP5J 在肝癌进展中的作用提供新参考。重要的是，实验观察到ATP5J 可调节线粒体膜电位水平，进一步表明ATP5J 是调节肝癌细胞线粒体功能的关键指标之一。综上，推测ATP5J 是细胞能量代谢和ROS产生的重要介质。

在肿瘤转移过程中，线粒体ATP 和线粒体膜电位水平的升高，可显著增强肿瘤细胞能量转换，这无疑给肿瘤的治疗带来了挑战［15］。针对大量的线粒体功能蛋白，仅有少数的蛋白在肿瘤治疗中有研究意义［16］。ATP5J 是ATPase 的一部分，在能量转化过程中至关重要，有研究显示ATP5J 表达水平的变化可控制肌肉中的能量代谢和线粒体表型［17］。在结直肠癌研究中，下调ATP5J 表达会减弱结肠癌细胞迁移，提示ATP5J 成为结直肠癌患者预后的一个重要因素［4］。敲低ATP5J表达可增强耐药细胞对靶向药物治疗的敏感性［18］。Yang 等［19］研究表明，雌二醇通过抑制雌激素受体β （ERβ）与ATP5J 的相互作用，从而抑制JAK1-STAT6信号通路，抑制肝癌进展。本实验结果显示，过表达ATP5J可显著上调线粒体膜电位水平、促进线粒体ATP 产生，介导细胞骨架重塑，增强肝癌细胞侵袭能力；然而，敲减ATP5J则出现相反的作用。总之，ATP5J 可能通过调节线粒体膜电位和线粒体ATP 产生重塑细胞骨架，影响肝癌细胞转移。本研究结果与Lusby等［20］的观点描述相似，也表现出ATP5J 在肿瘤细胞侵袭中的作用。但是与Yang 团队阐述的角度不同，本实验主要从线粒体功能、能量代谢到细胞骨架重塑的角度，揭示了ATP5J在肝癌细胞转移中的作用。肿瘤细胞生物学行为离不开能量供应，本研究从细胞实验中观察到肝癌细胞能量代谢途径的相关因子——ATP5J，这为研究肝癌发展和靶向治疗方案提供参考依据。未来将深入开展ATP5J在肝癌细胞代谢中的作用。

TOMM20 在肝癌组织中高表达，可促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移［21］。在人软骨肉瘤细胞中，过表达TOMM20 可诱导软骨肉瘤肿瘤在体内生长，表明TOMM20 在软骨肉瘤细胞增殖、细胞凋亡抵抗和化疗抵抗中的作用［5］。本实验结果显示，ATP5J可调节肝癌细胞TOMM20 表达，ATP5J 具有介导肝癌细胞侵袭、调节线粒体膜电位和ROS的作用，而在这个过程中观察到，ATP5J 可能通过TOMM20 调节线粒体功能和线粒体ATP 产生，介导细胞骨架重塑影响肝癌细胞转移。ATP5J 对TOMM20 的调节作用为肝癌细胞能量代谢机制提供了新的参考，推测这种作用关系与肝癌进展有关。

综上，ATP5J 可调节肝癌细胞线粒体能量转化，其可能通过TOMM20 调节线粒体膜电位水平和线粒体ATP产生介导细胞骨架重塑影响肝癌细胞转移。