PAI-1 和FV 基因多态性与静脉血栓的临床意义

陈晨 刘艳枚 曾汶烯 成彬 周美芳 尹卫国★

静脉血栓由于血液非正常于深静脉内凝结而产生，血栓脱落沿血流移动造成血栓栓塞，可导致脑卒中、冠心病等严重并发症［1］。静脉血栓的遗传危险因素包括纤溶酶原激活物抑制剂-1（Active Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1）和凝血因子V（Factor V，FV）。PAI-1 可灭活组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA），调节机体纤溶系统活性，PAI-1基因启动子区-675 位5G 向4G 突变，导致PAI-1 含量或活性增加从而降低纤溶活性［2-3］。FVLeiden 点突变时凝血因子V 分子构象发生改变，导致活化蛋白质C（activated protein C，APC）灭活凝血因子的速率降低，产生APC 抗凝活性抵抗现象（activated protein C resistance，APCR），促凝与抗凝系统失衡，血栓形成［4-5］。本研究采用数字荧光分子杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）这一新兴的分子细胞遗传学技术，它是用已知的标记单链核酸为探针，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸，从而在染色体上定位靶基因。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2020 年4 月至2021 年8 月就诊于清远市人民医院的住院患者2 281 例，平均年龄（62.38±15.15）岁，男性1 425 例，女性856 例。纳入标准：因临床需要或个人要求进行静脉血栓相关基因检测患者的标本数据；排除标准：因标本状态不佳、实验操作错误等原因检测失败患者的标本数据。本研究已通过豁免知情同意申请。本研究已获得院伦理委员会批准（伦理审查批件号为IRB-2022-012）。

1.2 标本要求

EDTA 抗凝静脉血2～3 mL，4℃低温保存，保存时间不宜超过24 h。

1.3 试剂和仪器

测序反应通用试剂（25 μL/支，京大械备20150009 号）和核酸纯化试剂（10 mL/瓶，京大械备20150010 号）由北京华夏时代基因科技发展有限公司提供，微量荧光检测仪（Fluotec 48E）由西安天隆科技有限公司提供，sanger 测序仪（ABI 3730xl DNA Analyzer）由美国ABI 提供。

1.4 方法

1.4.1 实验操作步骤

取150 uLEDTA 抗凝静脉全血加到分装有1.2 mL 1×NH4Cl 预处理液的EP 管中，上下颠倒10 次，室温静置5 min 以裂解红细胞，液体颜色变为澄清红色为准。室温离心（3 000 rpm，5 min，离心半径8 cm），弃上清，EP 管底沉淀加入1 mL 1×NH4Cl 预处理液以重悬白细胞，再次离心弃上清，沉淀加入50 μL核酸纯化试剂，反复吹打混匀后室温静置30 min，待检测。

1.4.2 符合率分析

采用数字荧光分子杂交法检测5 个临床样本（s1-s5）PAI-1和FV基因型，采用“金标准”Sanger测序法进行符合率的性能验证（先加盲再揭盲）。

1.4.3PAI-1和FV基因多态性分析

分析2 281 位患者PAI-1和FV基因型分布及等位基因频率，了解男、女性和心、脑血管疾病、肿瘤患者基因多态性差异；收集心、脑血管疾病和肿瘤患者基线资料，比较三组PAI-15G5G 和5G4G/4G4G 基因型患者的临床血液指标差异。

1.5 统计学分析

采用统计学软件Grandpad 处理数据。计量资料采用（）表示，两两比较t检验，多组间比较采用方差分析。计数资料用n（%）表示，行χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 符合率比较

数字荧光分子杂交法与Sanger 测序结果完全一致，符合率达100%。见表1。

表1 方法符合率结果Table 1 Method compliance results

2.2 静脉血栓相关基因PAI-1 和FV 基因多态性

PAI-1基因型分布符合遗传平衡定律；FV基因极少突变，等位基因突变频率仅为0.04%，多为野生纯合型，FV基因型分布不符合遗传平衡定律（P＜0.0001）。见表2。

表2 PAI-1 和FV 基因在人群中的总体分布［n（%）］Table 2 The overall distribution of PAI-1 and FV gene in the population［n（%）］

2.3 男女性静脉血栓相关基因PAI-1 和FV 基因多态性

男、女性组PAI-1和FV基因型分布和等位基因频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3、表4。

表3 PAI-1 基因在男女性组分布［n（%）］Table 3 Distribution of PAI-1 gene in male and female groups［n（%）］

表4 FV 基因在男女性组分布［n（%）］Table 4 Distribution of FV gene in male and female groups［n（%）］

2.4 不同疾病患者静脉血栓相关基因PAI-1 和FV 基因多态性表达差异

心血管疾病组、脑血管疾病组、肿瘤组和对照组这4 类患者PAI-1和FV基因型分布和等位基因频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5、表6。

表5 PAI-1 基因在不同疾病中的多态性分布［n（%）］Table 5 Polymorphism distribution of PAI-1 gene in different diseases［n（%）］

表6 FV 基因在不同疾病中的多态性分布［n（%）］Table 6 Polymorphism distribution of FV gene in different diseases［n（%）］

2.5 临床基线资料分析

心血管疾病组、脑血管疾病组和肿瘤组的年龄、吸烟史、高血压史、冠心病史、血红蛋白、血小板、随机血糖、纤维蛋白原、凝血酶时间、D 二聚体、甘油三酯、低密度脂蛋白比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表7。

表7 心、脑血管和肿瘤疾病的临床资料比较［（），n（%）］Table 7 Comparison of Clinical Data of Cardiovascular，Cerebrovascular and Tumor Diseases［（），n（%）］

2.6 PAI-1 基因与临床资料相关性

心血管疾病组、脑血管疾病组和肿瘤组PAI-15G5G 和5G4G/4G4G 基因型患者的多项临床血液指标表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表8。

表8 三组PAI-1 5G5G 和5G4G/4G4G 基因型患者的临床血液指标比较（）Table 8 Comparison of clinical blood indexes in three groups of patients with PAI-1 5G5G and 5G4G/4G4G genotypes（）

表8 三组PAI-1 5G5G 和5G4G/4G4G 基因型患者的临床血液指标比较（）Table 8 Comparison of clinical blood indexes in three groups of patients with PAI-1 5G5G and 5G4G/4G4G genotypes（）

3 讨论

药物基因检测可预测患者对于不同药物的疗效和不良反应的程度，对临床用药起到一定的指导作用［6］。本研究采用微量荧光检测仪检测临床标本静脉血栓PAI-1和FV基因，同时将临床标本加盲再揭盲进行Sanger 测序法验证，发现两种检测方法结果完全符合。

PAI-1 抑制活性纤溶酶的产生而促进血栓形成，在心脑血管疾病和肿瘤进展中起着关键作用［7-8］，PAI-1 不仅影响血浆纤溶和凝血系统平衡，而且在实体肿瘤侵袭、浸润和转移中发挥重要作用。PAI-1基因多态性与阿尔茨海默病、代谢综合征及癌症风险有一定关联［9-10］，PAI-1基因的过度表达可导致血栓风险增高，4G5G/4G4G 等位基因携带者PAI-1 表达水平较高［11］，4G5G、4G4G 发生静脉血栓的风险分别是5G5G 型（正常纤溶型）的4.85、6.35 倍。本研究发现说明PAI-1基因多态性与性别及疾病类型并无明显相关性，PAI-1基因多态性可能是静脉血栓的遗传风险因素。

FV Leiden 突变是静脉血栓常见的遗传危险因素［12］，而FV Leiden 突变因种族群体而异，部分人群中少见FV Leiden 突变［13］。本研究结果说明本地区FV基因检测缺乏一定的临床药物指导意义，考虑弃除FV基因临床检测项目，不再将其纳入临床常规检测。这和已有研究符合，FV基因突变在亚洲地区极为罕见［14］。

分析本研究结果进一步分析PAI-1基因与临床资料相关性时，发现心、脑血管疾病组和肿瘤组PAI-15G5G 和5G4G/4G4G 基因型患者的各项临床指标的表达差异均无统计学意义。由此说明PAI-1基因多态性与心、脑血管和肿瘤组患者疾病进程并无明显相关性，推测PAI-1基因多态性可能是静脉血栓发生发展的独立危险因素［15］，检测PAI-1基因可能有助于静脉血栓的初级预防。

此次研究仍存在一定局限性：①临床疾病种类有待丰富和更加细化；②各组别样本量相对不足；③介于本研究仅对存在静脉血栓高危风险并有给药需求的患者方可申请本检测项目，故而正常对照组以未有基础疾病人群数据进行分析。

综上所述，本实验室荧光原位杂交技术可替代Sanger 测序以检测静脉血栓PAI-1和FV基因多态性，结果可信并为临床治疗提供准确依据。PAI-1基因多态性可能是静脉血栓发生发展的独立危险因素，有助于静脉血栓的初级预防、治疗和预后。药物基因检测可以协助临床医生在药品选择、剂量控制及联合用药等方面早日实现个体化用药的精准医疗。