J亚群禽白血病病毒血液核酸筛查技术的建立

董欣怡,李锦群,陈钦玺,廖 明,曹伟胜

(华南农业大学兽医学院,人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室,农业部兽用疫苗创制重点实验室,广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室,广州 510642)

禽白血病(avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)引起的一类禽肿瘤性疾病。目前ALV可分为A～K共11个亚群,其中,ALV-J流行最广,可引起鸡的髓细胞瘤、血管瘤、纤维肉瘤等,对养禽业危害巨大[1-6]。目前,尚无针对AL的疫苗或药物,对种鸡群进行净化是防控AL的主要措施[7-9]。

目前,病毒分离法是净化检测外源性ALV的金标准,该方法主要通过将采集的血浆等临床样品接种细胞,培养7～9 d后用ALV p27抗原ELISA试剂盒进行检测,该方法检测周期长且成本高[10-11]。此外,当种鸡场ALV流行率低时,利用病毒分离法对鸡逐一进行检测,会造成耗材和人工的极大浪费。核酸检测法具有检测周期短、特异性强、灵敏度高的优点[12]。其中,实时荧光定量PCR方法(quantitative real-time PCR)发展成熟,自动化程度高,已被广泛用于各类病原检测工作中[13-14]。但在检测大批量样本时,也存在成本偏高的缺点。

本研究结合核酸检测技术和混样检测模式,建立了一套适用于ALV-J低流行率场景下的快速筛检ALV-J感染鸡的血液核酸筛查技术(ALV-J-B-qPCR),旨在加快种禽场外源性ALV的净化进程。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

DF-1细胞、ALV-A GD13-1株、ALV-B CD08株、ALV-J SCAU-HN06株、ALV-K GDFX0601株、ALV-E HN1301株、马立克病病毒(MDV)Md5株、禽流感病毒(AIV)G1-like株cDNA、禽网状内皮增生症病毒(REV)SNV 株cDNA均由本实验室保存;鸡抗凝血样采集自广东省3个正在进行AL净化的种鸡场;ALV p27抗原ELISA检测试剂盒是哈尔滨国生生物科技股份有限公司产品;通用柱式基因组DNA提取试剂盒购自广州攻逸生物科技有限公司;Hieff qPCR SYBR Green Master Mix购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 引物序列

根据GenBank中ALV-Jpol及env基因序列,设计1对特异性检测ALV-J的qPCR引物F1/R1,同时以引物H5/H7作为ALV-J的PCR检测引物[28](表1)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 本研究使用的引物

1.3 标准质粒的制备

以ALV-J SCAU-HN06株cDNA为模板,利用引物F1/R1对目的片段进行PCR扩增。反应程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,25个循环;72 ℃ 8 min。胶回收目的条带,连接至pMD-19T载体上,转化至DH5α感受态细胞,挑取单菌落,置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养后提取质粒。将测序正确的标准质粒命名为pMD19-T-J。

1.4 qPCR反应条件的优化及标准曲线的建立

采用20 μL的反应体系,分别对退火温度(54、54.7、56.0、58.0、60、60.4、62.3、63.5、64 ℃)、引物终浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1)进行优化,得到最佳反应条件。再以拷贝数为7.15×102～7.15×109copies·μL-1的10倍倍比稀释的标准质粒为模板进行qPCR反应,绘制标准曲线,计算其相关系数R2及其扩增效率E。

1.5 qPCR的特异性、灵敏性和重复性试验

以ALV-A、ALV-B、ALV-K、ALV-E、REV、AIV、MDV等病毒的基因组DNA或cDNA为模板,以标准质粒为阳性对照,去离子水为阴性对照,进行qPCR反应,以分析所建立方法的特异性;以拷贝数为1×1010～1×100copies·μL-1的10倍倍比稀释的标准质粒为模板,分别进行qPCR和普通PCR检测,比较两种方法对标准质粒的最低检出限,以分析所建立方法的灵敏性;以1×104、1×105、1×106copies·μL-1的标准质粒为模板,进行qPCR的批内重复性试验和批间重复性试验(批内重复:每个稀释度的标准质粒设置3个重复并同时扩增;批间重复:在不同时间段对以上试验进行3次独立的重复),并统计Ct值的平均值、标准差和变异系数,以分析所建立方法的重复性。

1.6 临床样本检测

随机抽取90份鸡抗凝血,将离心的血浆接种DF-1细胞,维持培养9 d后收集细胞培养液,用p27抗原ELISA试剂盒进行ALV检测,对阳性样品的细胞沉淀用H5/H7引物进行ALV-J特异性检测;提取上述90份细胞沉淀RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板,分别用建立的qPCR方法和普通PCR方法进行ALV-J检测;分析比较以上3种方法的检出率。

1.7 核酸筛查检测模板的筛选

以15份经病毒分离和亚群鉴定为ALV-J阳性的鸡血液样本和1份阴性鸡血液样本为材料(ALV阳性样本为经病毒分离后细胞培养上清ELISAS/P值高于0.2的样本,反之为阴性样本,下同),分别制备这16份样本的抗凝血DNA、血细胞DNA、外周血淋巴细胞DNA、外周血淋巴细胞cDNA和血浆cDNA,进行ALV-J特异性PCR检测,并综合评估其检测准确度、操作复杂度和成本,选出最佳模板类型。

1.8 核酸筛查混样方法的探索

选取22份经病毒分离和亚群鉴定为ALV-J阳性的抗凝血样本,提取其抗凝血DNA为模板,进行qPCR检测,获得血液原液检测Ct值。同时,将上述抗凝血样本用于以下3种混样方法的探索试验。

1.8.1 蒸馏水破裂红细胞法提取混合血液DNA的混样方法 鸡红细胞可在蒸馏水中破裂并释放DNA,因此可用该方法粗提鸡抗凝血DNA。以100 μL为ALV-J阳性抗凝血与蒸馏水混合的总体积,分别将占体积比为0.5%、1%、2%和4%的抗凝血与相应体积的蒸馏水混合后剧烈震荡,待红细胞碎屑沉降后吸取1 μL上清作为模板,进行qPCR检测。根据检测结果确定最佳的血液-蒸馏水体积比并设计后续试验。

1.8.2 血液混样总体积为200 μL的混样方法 以200 μL作为混合总体积,分别将22份ALV-J阳性抗凝血按1∶2、1∶5、1∶8和1∶11体积比与阴性抗凝血充分震荡混匀(即阳性血样的3倍稀释、6倍稀释、9倍稀释和12倍稀释),再从中吸取10 μL混合血液,提取其DNA作为模板,进行qPCR检测,分析不同混合比例对检测准确度的影响。

1.8.3 血液混样总体积为10 μL的混样方法 以10 μL作为混合总体积,分别将22份ALV-J阳性抗凝血按1∶2、1∶5、1∶8和1∶11体积比与阴性抗凝血充分震荡混匀(即阳性血样的3倍稀释、6倍稀释、9倍稀释和12倍稀释),提取其DNA作为模板,进行qPCR检测,分析不同混合比例对检测准确度的影响。

1.9 ALV-J血液核酸筛查技术的建立

根据上述qPCR方法,确定的最佳检测模板和最佳混样方法,组合建立了ALV-J血液核酸筛查技术,并命名为ALV-J-B-qPCR。

1.10 临床ALV-J血液核酸筛查模拟试验

选取17份ALV-J阳性血样和383份阴性血样进行随机排列,模拟流行率为4%～5%的临床检测场景,以k=5的混样规模分80个混合样本组,提取DNA进行第一轮qPCR检测,对检测为反应性的混合样本组进行第二轮单个样品的DNA提取和qPCR检测;同样,选取6份ALV-J阳性血样和394份阴性血样进行随机排列,以k=10的混样规模,进行预期流行率为1%～2%的临床血液核酸筛查模拟试验。

1.11 统计分析方法

运用Prism 9、SPSS 21.0软件对试验数据进行处理和分析。P>0.05 表示差异不显著,P<0.05表示差异显著。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,ns.P>0.05。

2 结 果

2.1 qPCR标准质粒的构建与鉴定

以ALV-J cDNA为模板,采用引物F1/R1进行PCR扩增,电泳结果显示条带大小约204 bp(图1a),与预期大小一致。将目的片段连接至pMD19-T并转化至DH5α感受态细胞,挑取单克隆菌落并提取重组质粒。测序结果显示,标准质粒pMD19-T-J构建成功。

A. 标准质粒PCR扩增(M. DL2000 DNA相对分子质量标准;1～2.标准质粒;3.阴性对照);b.标准曲线a. Standard plasmid PCR amplification (M. DL2000 DNA marker; 1-2. Standard plasmid; 3. Negative control); b. Standard curve

2.2 qPCR反应条件优化和标准曲线的建立

qPCR反应条件的优化结果显示,最佳退火温度为58 ℃,最佳引物终浓度为0.2 μmol·L-1。最终确定20 μL qPCR反应体系:上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,qPCR预混液10 μL,DNA模板1 μL,去离子水8.2 μL;反应程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s,39个循环。将拷贝数为7.15×109～7.15×102copies·μL-1共8个浓度梯度的标准质粒进行qPCR扩增,并绘制标准曲线,结果显示,标准曲线方程为y= -3.329 8x+ 41.071,R2= 0.999 5,扩增效率E=100%(图1b)。

2.3 qPCR的灵敏性、特异性、重复性

结果显示,所建立的qPCR方法对标准质粒的最低检测限为1×102copies·μL-1,而普通PCR的最低检测限为1×103copies·μL-1(图2),表明所建立的qPCR方法的灵敏性高于普通PCR,为普通PCR的10倍;分别以ALV-A、ALV-B、ALV-K、ALV-E、REV、AIV的cDNA和MDV 的DNA作为检测模板,以ALV-J标准质粒为阳性对照,去离子水为阴性对照,进行qPCR扩增,结果显示,仅ALV-J标准质粒出现特异性扩增,表明该方法的特异性良好(图3);利用1×104、1×105和1×106copies·μL-13个浓度的标准质粒分别进行批内和批间的qPCR重复性试验,结果显示,批内重复性试验的变异系数为0.122%～0.505%,批间重复性试验变异系数为0.279%～0.745%,两组变异系数均小于1%,表明建立的qPCR方法具有良好的重复性(表2)。

图3 qPCR特异性试验结果Fig.3 Specificity test result of the qPCR

表2 qPCR重复性试验结果

表3 1%～2%预期流行率下的ALV-J-B-qPCR法与病毒分离法的检测结果

表4 4%～5%预期流行率下的ALV-J-B-qPCR法与病毒分离法的检测结果

2.4 临床样品检测

随机抽取90份鸡抗凝血,分离血浆并接种至DF-1细胞,培养9 d后通过ALV p27抗原ELISA共检出11份阳性,阳性DF-1细胞培养物经PCR鉴定表明均存在ALV-J感染,表明p27 ELISA方法的ALV-J检出率为12.2%(11/90);以上述90份DF-1细胞cDNA为模板,分别利用普通PCR和所建立的qPCR进行ALV-J检测,结果显示,普通PCR ALV-J检出率为12.2%(11/90),qPCR的ALV-J检出率为15.6%(14/90),且所有被p27 ELISA和普通PCR检出的样本,均可被qPCR方法检出,表明所建立的qPCR方法比PCR方法和p27 ELISA方法灵敏性高。

2.5 核酸筛查模板筛选

结果显示,5种检测模板中,外周血淋巴细胞cDNA的ALV-J阳性检出率为46.67%(7/15),血浆cDNA的ALV-J阳性检出率为13.33%(2/15),抗凝血DNA、血细胞DNA和外周血淋巴细胞DNA 3种模板的ALV-J阳性检出率为100%(15/15),其中,外周血淋巴细胞DNA需要从抗凝血中分离淋巴细胞,需额外购买试剂盒,成本高且操作复杂,而血细胞DNA的制备需要先离心抗凝血,比直接采用抗凝血操作复杂,因此选定检测准确度高、成本低、操作复杂度低要求的抗凝血DNA作为后续试验的检测模板。

2.6 核酸筛查混样方法的探索

2.6.1 蒸馏水破裂红细胞法提取混合血液DNA的混样方法 以22份ALV-J阳性的抗凝血为材料,分别将占体积比为0.5%、1%、2%和4%的抗凝血与相应体积的蒸馏水混合并剧烈震荡后吸取上清DNA进行qPCR检测,结果显示,血液占比为0.5%、1%、2%和4%的4个组的平均Ct值均介于31～32,且组间差异均不显著(P>0.05)(图4),显著低于DNA试剂盒提取的原血样组DNA的平均Ct值26.44,灵敏性差。

图中未做显著性标记表示各组数据间的差异性均不显著No significant marks were made in the figure, indicating that the differences between the groups of data were not significant

2.6.2 血液混样总体积为200 μL的混样方法 以200 μL作为混合总体积,分别将22份ALV-J阳性抗凝血与阴性抗凝血3、6、9和12倍稀释后吸取10 μL,提取其DNA作为模板进行qPCR检测,结果显示,3、6、9和12倍稀释组的平均Ct值分别为27.96、29.18、29.27和28.74,相比原血样组的核酸检测平均Ct值26.44分别增加了1.52、2.74和2.83、2.30,且单个样本检测结果均呈反应性。其中,3倍稀释组与原血样组的平均Ct值无显著差异(P>0.05),6、9和12倍稀释组与原血样组的Ct值差异均显著(P<0.05)。值得注意的是,3、6、9和12倍稀释组的平均Ct值随着稀释倍数的增加先上升后下降,12倍稀释组的平均Ct值低于6和9倍稀释组(图5a)。

A. 总体积为200 μL的混样方法;b. 总体积为10 μL的混样方法。**.P<0.01,***.P<0.001,ns.P>0.05a. Scheme with a mixed samples volume of 200 μL; b. Scheme with a mixed samples volume of 10 μL. **.P<0.01, ***.P<0.001, ns.P>0.05

2.6.3 血液混样总体积为10 μL的混样方法 以10 μL作为混合总体积,分别将22份ALV-J阳性抗凝血与阴性抗凝血3、6、9和12倍稀释后提取其总DNA进行qPCR检测,结果显示,3、6、9和12倍组的平均Ct值分别为27.98、29.13、29.71、29.85,相比原血样组的核酸检测平均Ct值26.44分别增加了1.54、2.69、2.73、3.41,但有1份血样在12倍稀释组中未出现反应性。其中,3倍稀释组与原血样组的平均Ct值无显著差异(P>0.05),6、9和12倍稀释组与原血样组的Ct值差异均显著(P<0.05)(图5b)。相对混样总体积为200 μL的混样方法,混样总体积为10 μL的方法中3、6、9和12倍稀释组的平均Ct值随着稀释倍数的增加逐渐升高,其结果更合理准确,因此采纳混样总体积为10 μL(混样规模<12)的混样方法。

2.7 临床ALV-J血液核酸筛查模拟试验

选取17份ALV-J阳性抗凝血和383份阴性抗凝血随机排列,以模拟流行率为4%～5%的临床检测场景,以k=5的混样规模分为80个混合样本组,提取其抗凝血DNA进行第一轮qPCR检测,结果显示,共有20个混合样本组呈反应性。进一步提取这20个混合样本组对应的100份抗凝血DNA进行第二轮qPCR检测,共检出25份反应性样本。ALV-J-B-qPCR总检出率为6.25%,比病毒分离法高2%。两轮qPCR共检测样本180份,仅占样品总数的45%。同样,选取6份ALV-J阳性抗凝血和394份阴性抗凝血进行随机排列,以模拟流行率为1%～2%的临床检测场景,以k=10的混样规模分为40个混合样本组,结果显示,第一轮qPCR检测共有8组混合样本组呈反应性,第二轮qPCR检测共检出9份反应性样本,ALV-J-B-qPCR总检出率为2.25%,比病毒分离法高0.75%。两轮qPCR共检测样本120份,仅占样品总数的30%。

对2种预期流行率下ALV-J-B-qPCR和病毒分离法的检测结果进行卡方检验和Kappa一致性检验,结果显示,在1%～2%、4%～5%预期流行率下,卡方检验结果的χ2值分别为0.611、1.608,并且P值均大于0.05,说明2种方法差异无统计学意义;Kappa一致性检验结果的Kappa值分别为0.796、0.799,并且P值均小于0.05,说明2种方法具有显著的一致性,且结果有统计学意义(表3、4)。

以上结果表明,ALV-J-B-qPCR具有良好的可行性。

3 讨 论

目前的混样核酸检测策略,都会不可避免地稀释病毒核酸,当病毒核酸低于检测限时,就会发生漏检。因此,应合理设置混样规模,尽量减少假阴性风险。此外,还要合理选择混样类型和灵敏的检测方法,以保证检测结果的准确性[29-30]。新型冠状病毒流行期间,检测工作中通过多样本混检,可大大提高特定区域内大规模人群筛查和控制COVID-19疫情的能力[31]。孙微超等[32]评价了6混样和48混样在血液筛查工作中的适用性,发现两种混样方法的检测结果具备良好的一致性,48混样可大幅提高检测效率,但漏检风险略高。

随着国家对家禽种业重视程度的提高,我国许多规模化种禽场纷纷加大对外源性ALV的净化力度,其外源性ALV流行率已降至较低水平,此时使用病毒分离法逐个检测和淘汰阳性鸡,检测样本量大而淘汰病鸡数量少,且同时具有检测周期长的不足[33]。此外,病毒分离法所需的ELISA检测试剂盒价格昂贵,会增加净化成本。以qPCR为代表的核酸检测方法能大幅度缩短检测周期,其高灵敏性也能保障检测的准确性。同时,净化后期的鸡群ALV流行率低,符合混样检测的应用场景,可大幅减少检测数量,达到节约成本的目的。因此,本研究首次尝试建立针对ALV-J的血液核酸筛查方法。

本研究首先建立了ALV-J SYBR Green Ⅰ荧光定量检测方法。结果表明,该方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可作为后续试验的基础。

适宜的检测模板对检测结果的准确性具有重要影响[34]。在检测模板的选择中,本研究对5种检测模板进行评估,发现抗凝血DNA最符合准确度高,操作复杂度低、成本低的要求,因此以鸡抗凝血DNA为最终的检测模板。

在混样方法的探索中,蒸馏水破裂鸡红细胞法提取的DNA模板用于核酸检测的灵敏性差,因此不予采用。在混样总体积为200 μL的混样方法中,出现了阳性样本稀释倍数增加但平均Ct值反而降低的情况,分析原因,可能是由于抗凝血质地不均一,多个血样难以完全混匀,或混合血液产生凝集反应,造成血液性质改变[35],导致用于提取核酸的10 μL混合血样不能代表组内的平均水平。相比之下,混样总体积为10 μL的混样方法中,随稀释倍数的增加,核酸检测的平均Ct也逐渐增加,更合理准确,因此采用混合总体积为10 μL的混样方法,但该方法在12倍稀释组中有1例ALV-J样本未检出反应性,因此实际应用中应尽量将混样规模控制在12以下。

在2种预期流行率的临床筛查模拟试验中,ALV-J-B-qPCR的检出率均比病毒分离法高,且被病毒分离法检出的样本均可被ALV-J-B-qPCR检出,说明ALV-J-B-qPCR灵敏性更高。此外,预期流行率为1%～2%的模拟试验的总检测量较预期流行率为4%～5%的模拟试验更少,可印证本方法更适合流行率低的应用场景。Kappa检验可评估两种检测方法的一致性,卡方检验重在评估两种方法之间的差异性[36]。通过卡方检验和Kappa检验评估ALV-J-B-qPCR和病毒分离法的检测差异性和一致性,结果表明2种方法具有显著的一致性。

4 结 论

本研究结合qPCR方法和混样检测模式,首次建立了ALV-J血液核酸筛查技术。该技术存在以下几点优势:无需病毒分离过程,可大幅缩短检测周期;避免使用价格昂贵的ELISA检测试剂盒,且能大幅降低检测总量,节约成本;灵敏性高,有利于在大规模鸡群中精准筛检出ALV-J感染鸡。该技术尤其适用于低ALV-J流行率场景下鸡群的快速筛检,为规模化种鸡场加快ALV净化进程提供了新的思路和方法。