伪狂犬病病毒编码的内膜蛋白生物学功能研究进展

李艺璇,牛静轶,李 港,万 超,方仁东,叶 超

(西南大学动物医学院 动物健康与动物性食品安全国际合作联合实验室,重庆 400715)

伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是导致动物患伪狂犬病或奥叶兹基氏病的感染性致病因子,它能感染多种家畜以及野生动物,从而引发伪狂犬病。猪是PRV的自然宿主,感染PRV会导致猪的致死性脑炎、呼吸障碍、母猪繁殖障碍和新生仔猪的高死亡率。PRV的致病性还与其潜伏感染的特性有密切联系,初次感染时病毒的基因组可在神经元内建立潜伏感染,在应激刺激后,病毒可以被重新激活并产生裂解感染[1]。由于其具有较强的致病性以及潜伏感染的特性,PRV在世界范围内给养猪业造成了严重的经济损失。

PRV的学名是猪疱疹病毒1型,属于疱疹病毒科,甲型疱疹病毒亚科,水痘病毒属。PRV包含一个约143 kb的双链DNA基因组,由长独特区 (unique long region, UL)、短独特区 (unique short region, US)、末端重复序列 (terminal repeat, TR) 以及内部重复序列 (internal repeat, IR) 组成,至少包含72个基因[2-4]。成熟的病毒粒子从内而外依次由基因组DNA、衣壳、内膜蛋白层和囊膜组成。内膜蛋白层是疱疹病毒特有的蛋白质层,位于囊膜和核衣壳之间,是连接病毒衣壳和囊膜的重要间质,因此又称为被膜蛋白或间质蛋白[5-7]。PRV编码至少18种内膜蛋白基因,分别为US2、US3、UL13、UL7、UL11、UL14、UL16、UL21、UL23、UL36、UL37、UL41、UL46、UL47、UL48、UL49、UL50、UL51;其中,UL13、UL21、UL36、UL37、UL7、UL11、UL14、UL16、UL50、UL51为病毒的核心基因,在疱疹病毒科成员中高度保守,其编码的蛋白质参与疱疹病毒复制的基本过程;而US2、US3、UL23、UL41、UL46、UL47、UL48、UL49为病毒非核心基因,也可在PRV感染和复制过程中起重要调控作用[8-9]。作为疱疹病毒的一种独特结构,目前研究表明内膜蛋白在病毒生命周期的多个方面发挥着重要作用,包括参与核衣壳移位到细胞核、病毒粒子组装[10-11]、病毒入侵和病毒粒子形态形成过程以及宿主先天免疫的调节等[12-13]。

1 核心基因编码内膜蛋白的生物学功能

1.1 pUL13的生物学功能

轴突转运对于神经侵入性疱疹病毒在外周神经节中成功建立感染(逆行运输)以及病毒随后从潜伏期重新激活后扩散到暴露的体表(顺行转运)至关重要。pUL13作为内膜蛋白中重要的蛋白激酶,也是病毒轴突转运的潜在调节因子。通过对UL13和US3双基因突变病毒在背根神经节 (dorsal root ganglion, DRG) 神经元上复制情况进行研究,发现突变病毒感染后新组装的衣壳逆行运输明显增多,这阻止了衣壳被有效地递送到远端轴突[14],表明病毒蛋白激酶pUL13和pUS3能促进病毒衣壳向轴突远端的运输,因此缺失UL13的PRV与野生型相比病毒滴度会有所降低。另外,研究表明单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1, HSV-1)的US3具有调控UL31和UL34在核周定位的作用,而pUL13能够使US3磷酸化,进而控制UL31和UL34在核周边相互作用形成复合物,该复合物可进一步介导病毒核衣壳从核内转运到胞质的过程,因此UL13在HSV-1病毒出核中发挥重要作用[15]。类似的,单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus type 2, HSV-2)的UL13基因单独也可以引起核纤层蛋白A和C的构象变化,并使核纤层蛋白B1从核边缘重新分布到核内颗粒结构中。此外,HSV-2UL13在体外直接磷酸化核纤层蛋白A、C和B1,HSV-2感染也发现了UL13单独表达时导致的核纤层蛋白改变,表明HSV-2UL13能通过改变核纤层蛋白从而允许病毒出核[16]。研究人员通过CRISPR/Cas9技术在PRV的UL13基因上插入用于融合表达的eGFP标签构建PRV UL13-eGFP病毒,然后通过试验观察到在病毒增殖过程中,融合蛋白UL13-eGFP聚集在核衣壳附近,证明pUL13也可能参与PRV的出核[17]。

pUL13 还参与调控宿主天然免疫,其可通过抑制转录因子核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的活化来抑制RIG-I和MDA5的表达,从而作为RIG-I样受体 (RIG-I like receptors, RLR) 介导的抗病毒反应的拮抗剂。具体表现为过表达pUL13会显著抑制RIG-I和MDA5的mRNA和蛋白质水平,进而抑制RIG-I或MDA5介导的免疫反应[18]。此外,猪源CCHC型锌指蛋白3 (CCHC-type zinc finger protein 3, ZCCHC3) 是一种抗病毒分子,可与RIG-I和cGAS相互作用以调节针对病毒感染的先天免疫信号传导,而PRV编码的pUL13和pUL24蛋白能够抑制ZCCHC3的表达,从而拮抗ZCCHC3的抗病毒作用[19]。

pUL13还能够通过调控干扰素基因刺激因子 (stimulator of interferon genes, STING) 激活来抑制STING介导的干扰素 (interferon, IFN) 抗病毒信号传导。在机制上,pUL13与STING的CDN结构域相互作用,并募集E3泛素蛋白连接酶 (E3 ubiquitin protein ligase, RNF5) 以促进K27-/K29-连接的泛素化和STING的激活[20]。此外,UL13还可以通过靶向干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3, IRF3)进行泛素化和磷酸化来抑制cGAS-STING介导的IFN-β的产生[21-22]。UL13还可以通过调节DNA损伤标志物γH2AX引起DNA损伤反应 (DNA-damage response, DDR) 诱导细胞凋亡,其介导的γH2AX磷酸化在促进PRV复制和增殖中起着关键作用[23]。UL13也可以与过氧化物还原酶1 (peroxiredoxin 1, PRDX1) 相互作用,PRDX1是一种细胞抗氧化酶,可以通过与TANK结合激酶1 (TANK binding kinase 1, TBK1) 和IκB激酶ε (inhibitor κB kinase-ε, IKKε) 相互作用来促进IFN激活,而pUL13会使PRDX1泛素化,从而使其通过蛋白酶体途径被降解,最终降低PRDX1的表达和IFN激活[24]。由此可见,pUL13能够通过多种机制抑制宿主IFN抗病毒通路的激活。

1.2 pUL21的生物学功能

UL21基因在整个甲型疱疹病毒亚科中非常保守,其编码一种内膜蛋白。该蛋白对于PRV等病毒在培养细胞中的复制是非必需的,但其C末端可以与细胞质动力蛋白 (cytoplasmic dynein) 的轻链Roadblock-1相互作用,进而促进PRV在体内外的逆行性轴突转运,从而有助于PRV神经侵袭[25]。此外,在PRV减毒疫苗株Bartha-K61株(存在UL21基因的点突变)中用野生型病毒序列修复UL21位点后,病毒粒子恢复了体外和体内的有效跨神经元传播能力[26],表明UL21在促进PRV神经性感染方面发挥重要作用。

同属甲型疱疹病毒亚科的HSV-2UL21还具有促进病毒基因表达以及促进衣壳从细胞核排出的功能[27],提示pUL21在病毒蛋白表达和病毒粒子组装中发挥作用[28-29]。进一步,研究表明pUL21与其他内膜蛋白存在互作。例如将UL21、UL16和UL11同时突变后,病毒粒子的核内成熟阶段不受影响,胞质内的病毒粒子形态也只是发生了轻微变化,但是pUL21增强了pUL16和pUL11在三重转染细胞中的相互作用[30]。当pUL21与pUL11和gE形成复合体时,可能会对HSV-1在细胞间扩散以及二次包膜中发挥作用[31]。此外Michael等[32]研究发现,缺乏pUL21的PRV病毒粒子中,内膜层中pUL46、pUL49和pUS3的含量大大减少。由此可知,pUL21可通过与多种内膜蛋白互作招募其他蛋白参与病毒粒子组装。

UL21在PRV抵御宿主先天免疫方面也发挥了一定的作用,最近的研究发现pUL21通过Toll互作蛋白 (toll-interacting protein, TOLLIP) 介导的选择性自噬触发cGAS降解来抑制先天免疫。pUL21蛋白可作为支架招募E3泛素连接酶E3C催化cGAS在Lys384处的K27连接泛素化,此复合体后被TOLLIP识别并在溶酶体中降解,其中pUL21的N末端在该过程中发挥主要作用[33]。

1.3 pUL36的生物学功能

蛋白质pUL36(VP1/2)是最大的内膜蛋白,属于高度保守的内膜蛋白,一般通过与其他内膜蛋白互作,在病毒核衣壳的胞核内转运、出核以及出核后二次包膜化过程中均起重要作用[34]。而pUL36的合成则可能与pUL11和pUL16有关,Michael等[35]分析了PRV的7个单基因缺失突变体,确定了病毒粒子总体组成在缺失目的蛋白之后的变化,与野生型相比缺失pUL21、pUL49、pUL51、pUS3或pUS8的突变体中,pUL36的含量无明显变化,而缺失pUL11或pUL16的病毒粒子中的全长pUL36则少于野生型病毒粒子。

PRV的pUL36 N端区域可与第二大保守的被膜蛋白pUL37相互作用,共同构成内膜层的内层,影响病毒粒子的组装[36]。pUL36的N末端具有去泛素化活性,即逆向调控泛素化修饰,阻止蛋白质的降解[37]。N端去泛素酶编码结构域会使病毒在上皮细胞系中的增殖速率和在原代感觉神经元轴突中的转运频率降低,而C端则与感染细胞核中的衣壳组装有关[38-39]。此外PRV的pUL36中包含去泛素化特异性蛋白酶,将第26位氨基酸的保守活性部位半胱氨酸突变为丝氨酸后,pUL36蛋白N端的去泛素化活性被消除,病毒在体内外的复制减少,神经侵袭能力减弱,且二次包膜也会受到影响[40-42]。

1.4 pUL37的生物学功能

pUL37和pUL36一样,是一种高度保守的内膜蛋白,通常在病毒粒子的组装、定向运输以及二次包膜过程中发挥作用,pUL37通过与pUL36互作来控制病毒粒子形态,使核衣壳呈现出更有序的二十面体形态,二者的复合物可影响病毒的核衣壳出核以及后续的二次包膜,同时也会影响成熟的病毒粒子在胞质中的运输[43-46]。pUL37的N端(pUL37N)是紧凑的豆形β-螺旋结构,其中包含神经侵袭所必需的表面区域,C端则是一种构象灵活的单体,由一个细长的折叠核心和一个非结构化的C端尾部组成[47],这种动态结构可以使其在病毒复制过程中发挥不同的作用。

pUL37影响核衣壳的运动,研究表明pUL37的 N 末端与多亚基系连蛋白复合物 (multisubunit tethering complexes, MTCs) 具有结构相似性,MTCs通过将细胞内的运输囊泡捕获至特定的靶膜来控制真核细胞中的囊泡运输,pUL37可模拟MTCs功能介导病毒核衣壳沿着轴突长距离运动[48-49]。据报道,HSV-1以及PRV的pUL37末端有三个进化上保守的表面暴露区域:R1、R2 和 R3,其中,R2区域介导的神经侵袭的机制是调节轴突中的微管运输并将核衣壳运输至神经元胞体,从而促进病毒在胞内的运输[49-50]。若UL37区域发生突变,病毒将无法通过轴突逆行运输被运送到机体的外周神经节。通过免疫金法标记以及通过免疫电子显微镜观察其侵入过程,发现pUL36、pUL37和pUS3蛋白在PRV侵入细胞后存在于胞质内的衣壳中,而pUL11、pUL47、pUL48和pUL49内膜蛋白则丢失,提示病毒主要通过这三种衣壳相关的内膜蛋白与细胞质动力蛋白相互作用,将核衣壳转运到细胞核[51]。

pUL37影响完整病毒形态以及病毒的增殖,缺失UL37将会影响PRV病毒的粒子形态,导致被感染细胞胞质中只能检测到少量能进行二次包膜的成熟病毒粒子,与此同时,无囊膜的核衣壳在胞质中大量聚集。此外,缺失突变体PRV-ΔUL37可以在Vero细胞以及RK13细胞中进行高效的复制,但同属甲型疱疹病毒亚科的HSV-1在缺失UL37后则无法进行有效复制,提示UL37在HSV-1复制过程中发挥重要调节功能[52]。

pUL37还会影响病毒的二次包膜。甲型疱疹病毒的二次包膜通常发生在后高尔基体膜。有研究通过分析反式高尔基体 (trans-Golgi network, TGN) 的细胞标记物和破坏其功能,证明了TGN可作为HSV-1、PRV和VZV二次包膜的位点[53-54]。HSV-1感染细胞的免疫沉淀试验表明pUL37与gK和 pUL20能发生相互作用。pUL37和gK-pUL20复合体之间的相互作用可能会将pUL36-pUL37复合体与包膜联系起来,从而促进病毒粒子的二次包膜[55]。

1.5 pUL7、pUL11、pUL14、pUL16、dUTPase和pUL51的生物学功能

UL7及其同源基因在甲、乙、丙型疱疹病毒中是保守的,编码的pUL7是一种分子量大小约为29 ku的蛋白质,该蛋白主要影响PRV的病毒滴度,且不影响核衣壳的形成。使用UL7缺失病毒感染细胞,发现与使用野生型病毒相比,病毒滴度和蚀斑大小都有所降低[56]。使用PRV感染小鼠,发现感染缺失株的小鼠存活时间明显延长,可至70～72 h[57]。

UL11基因编码的内膜蛋白及其同系物在甲型疱疹病毒亚科中同样是保守的,其主要影响PRV的二次包膜[58-59]。PRVUL11编码一种分子量为10～13 ku的蛋白质,该蛋白质主要在病毒复制过程中在细胞质膜上被检测到。与野生型病毒相比,UL11缺失病毒滴度降低了约10倍,蚀斑大小减小了60%[60]。pUL11、gE和gM参与发生在细胞质中核衣壳的二次包膜,同时缺失UL11与gM的PRV感染细胞后,病毒的增殖量显著下降,电子显微镜观察到双缺失病毒在细胞质中的二次包膜过程中断[61]。

在甲型疱疹病毒中,UL14也属于较为保守的基因,在病毒感染后期表达。缺失UL14的HSV-1的二次包膜受到影响[62],而对缺失UL14的PRV研究表明,PRV的pUL14蛋白同样影响病毒的二次包膜与蚀斑大小,但对病毒的侵袭力没有影响,同时,缺失UL14延缓了小鼠的死亡时间[63]。UL14编码的pUL14在HSV-1、HSV-2中表现出一定的抗凋亡活性、而在PRV中pUL14则并没有表现出相应的抗凋亡活性[64-65]。

pUL16是疱疹病毒中的保守内膜蛋白,可通过与其他病毒蛋白和宿主蛋白互作来影响病毒和细胞的增殖。pUL16会与富含亮氨酸的三角状五肽重复结构蛋白 (leucine rich pentatricopeptide repeat containing, LRPPRC) 相互作用,从而参与半胱天冬酶非依赖性的细胞凋亡[66]。pUL16与UL35编码的囊膜蛋白VP26之间存在相互作用,有助于VP26易位到细胞核中,从而影响PRV的增殖和病毒滴度[67]。使用UL16、UL21双缺失病毒感染细胞,病毒复制几乎不受影响,但蚀斑大小和病毒滴度都有所下降。通过电镜观察发现,胞质中病毒粒子形态发生轻微变化,而细胞核内的病毒组装不受影响[30],表明pUL16在维持病毒粒子形态和感染性方面发挥重要作用。

UL50在PRV中编码脱氧尿苷三磷酸核苷酸水解酶(deoxyuridine 5′-triphosphate nucleotidohydrolase, dUTPase),dUTPase可以通过降解dUTP降低尿嘧啶在DNA中的错误掺入。研究表明敲除PRV的UL50基因后,其编码的内膜蛋白不影响病毒在细胞中的复制,但是在一定程度上延缓了病毒的增殖速度,对感染仔猪的致死率也有所降低[68-69]。dUTPase还可以通过促进IFN受体1的溶酶体降解,抑制Ⅰ型IFN信号传导,从而有助于PRV的免疫逃避[70]。

pUL51是甲型疱疹病毒亚科中的保守蛋白,其功能主要与病毒的二次包膜有关。Klupp等[71]分离并分析了一种缺乏UL51开放阅读框主要部分的突变体PRV-ΔUL51F。PRV-ΔUL51F的细胞试验显示,其滴度仅略有降低,但病毒蚀斑大小明显减小,约达到野生型PRV蚀斑大小的30%,同时,细胞质中存在大量处于不同包膜阶段的不完整结构,表明缺失UL51后病毒在细胞质中的二次包膜效率降低。

哺乳动物和禽类疱疹病毒基因组的系统发育分析表明,甲、乙、丙型疱疹病毒包含来源于共同祖先病毒的40个基因,这些基因被认为是核心基因[72]。在PRV编码内膜蛋白的基因中有UL7、UL11、UL13、UL14、UL16、UL21、UL36、UL37、UL50、UL51这10个已知的核心基因,均位于UL区域,且在进化上非常保守[8]。作为PRV基因组中高度保守的核心基因,它们参与疱疹病毒复制的基本步骤和感染的重要过程(表1),其中pUL36和pUL37对病毒的组装起决定性的作用;pUL13、pUL21、pUL36、pUL37则能促进PRV在神经元中的逆行运输;pUL13、pUL21、pUL36共同参与病毒的出核,帮助在细胞核内完成基因组复制的核衣壳脱离产生于细胞核内的初次包膜,被释放到胞质中,进一步在pUL11、pUL14、pUL21、pUL36、pUL37、pUL51的协助下完成二次包膜的过程;pUL13、pUL16、pUL21和dUTPase同时对宿主的天然免疫也存在一定程度的影响;同时,pUL36、pUL37、pUL7、pUL14、pUL16均能影响病毒的复制。

表1 核心基因编码的内膜蛋白生物学功能

2 非核心基因编码内膜蛋白的生物学功能

2.1 pUS2的生物学功能

目前已知使用最为广泛的PRV减毒疫苗株Bartha-K61株基因组的US区缺失了部分US2基因。作为PRV疫苗株中的缺失基因,US2的缺失会使感染的上皮细胞释放更多的感染性病毒粒子至胞外,从而导致浆细胞样树突状细胞过度活化,引发宿主的免疫反应[73-75]。另外,pUS2 蛋白序列不存在可识别的信号序列或跨膜结构域,但在感染早期,pUS2合成并定位于细胞质囊泡和质膜,位于其C末端的四个氨基酸包含一个CAAX基序,该序列是膜融合所必需的蛋白质异戊二烯化的表征信号,且pUS2蛋白也被包装为成熟病毒体内膜的一部分[76]。此外,PRV在感染期间会激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶 (MAPK/ERK) 信号通路,研究表明pUS2可与感染细胞中的活化的ERK的CD结构域结合,并通过将ERK隔离在细胞膜上而抑制ERK的激活[77-78]。

2.2 pUS3的生物学功能

pUS3是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,参与调节广泛的细胞过程,包括病毒出核、逆行运输、病毒入侵与增殖、以及参与宿主的免疫调节等[79-81]。首先,包括PRV和HSV-1在内的甲型疱疹病毒编码的pUS3蛋白可作为激酶介导细胞中mRNA的m6A甲基转移酶复合体中几种组分的磷酸化,并对m6A甲基化mRNA水平产生抑制[82]。研究表明,PRV的US3基因可转录成两个mRNAs,编码两种不同的pUS3亚型,分别是pUS3a和pUS3b,这两种蛋白的N末端序列和丰度不同。PRV的出核依赖较小的pUS3异构体和其完整的激酶活性,而缺乏较大的异构体对病毒复制没有显著影响[83]。

隧道纳米管(tunneling nanotubes, TNTs)是连接真核细胞并介导细胞间通讯的长桥状结构。Jansens等[84]的研究发现PRV pUS3诱导的隧道纳米管含有稳定的乙酰化和脱酪氨酸化微管,通过钙黏蛋白与邻近细胞相互作用,并允许细胞间分子通讯,促进细胞间病毒的入侵。pUS3还可以通过激活丝切蛋白(cofilin, CFL)介导肌动蛋白细胞骨架的重排来促进病毒的侵袭[85]。有研究表明,PRV的pUS3蛋白激酶使RhoA蛋白的S188位点被磷酸化修饰,抑制Rho GTPase信号传导,并引起宿主细胞骨架的重组,从而增强病毒通过基底膜到呼吸道黏膜等表面黏膜的上皮细胞中的增殖[86-87]。

另外,PRV pUS3在促进核衣壳有效逆行运输方面具有重要作用。逆行运输是指甲型疱疹病毒在进入轴突细胞质后,其核衣壳和相关的内膜蛋白启动细胞逆行运输机制促进病毒粒子组分向细胞核进行长距离移动,然后病毒DNA在细胞核内转录并完成裂解性感染或潜伏感染的过程。研究发现,当US3缺失时,只有较少的核衣壳在轴突移动,且它们在停止前移动的时间较短,这导致较少的核衣壳晚12 h后才到达细胞体产生裂解性感染,这表明pUS3对于核衣壳逆行运输是必需的。进一步发现,轴突中的Akt磷酸化是PRV核衣壳有效逆向转运所必需的,而pUS3能激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)-mTORC1通路并进而诱导在病毒感染早期轴突中的局部翻译[88],而PRV感染后轴突mRNA的局部翻译是促进核衣壳通过轴突的有效逆向运输的关键因素。综上,US3在PRV感染过程中能够参与诱导轴突局部翻译,从而在核衣壳运输到细胞体的过程中发挥关键作用。

pUS3在PRV等甲型疱疹病毒逃避宿主天然免疫中发挥重要作用。研究表明,PRV的pUS3蛋白激酶通过与NK细胞上依赖CD300a的氨基磷脂配体以及CD300a的结合,可以保护被感染细胞免受NK细胞介导的裂解[89]。而且,PRV的pUS3可以在 PRV 感染早期激活PI3K/Akt 和 NF-κB 通路,并保护细胞免受病毒诱导的细胞凋亡[90]。与PRV同属于甲型疱疹病毒亚科的HSV-1 US3具有与Akt相似的活性,可以直接靶向Akt信号通路下游的分子,导致被感染细胞Akt底物mTORC1等的磷酸化,从而刺激宿主细胞的翻译和病毒复制[91]。另外,PRV的pUS3蛋白是抑制干扰素β (IFN-β)表达的关键拮抗病毒因子,可阻断Ⅰ型IFN抗病毒应答。其pUS3蛋白可与IRF3相互作用并通过蛋白酶体途径降解IRF3 蛋白表达来抑制Ⅰ型IFN产生。此外,pUS3还可以抑制IRF3磷酸化并阻止其核转位,然后负向调节 IFN-β 的产生。因此 PRV pUS3 可以通过多种机制抑制 IFN-β的产生,参与PRV的先天免疫逃避[92]。此外,PRV 的pUS3蛋白可以通过激活感染细胞中的AKT/mTOR途径来降低自噬水平,从而逃避机体通过自噬这种抗病毒机制对PRV的清除[93]。

2.3 UL23编码的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)的生物学功能

UL23普遍存在于甲型疱疹病毒中,在PRV中UL23是重要的毒力基因。编码的内膜蛋白TK是一种胸苷激酶,含有320个氨基酸,属于非必需蛋白,可以催化脱氧胸苷磷酸化为dTTP从而参与DNA合成,如阿昔洛韦等疱疹病毒治疗常用药物,就是依赖TK激活的,并产生抑制病毒复制的作用[8]。

作为重要的毒力因子,TK可以影响PRV对小鼠和猪的致病性,接种TK缺失株的猪出现短暂的发热情况,而接种野生型PRV组则出现较为典型的临床症状,病理诊断发现三叉神经节出现急性炎症[94]。使用小鼠进行的感染试验也可证明TK缺失株可降低PRV的毒力和致死率[95]。TK缺失虽然会降低PRV的毒力,但几乎不影响PRV的复制[96],因此在构建PRV疫苗时,编码TK的UL23基因一般是首选基因,最初使用TK缺失株作为减毒疫苗的有保加利亚的MK25株等[97],目前国内许多团队也构建了缺失TK以及gE/gI的三基因缺失疫苗以应对临床上PRV变异株的广泛流行,如Cong等[98]构建的PRV-TJΔgE/gI/TK株、Wang等[99]构建的PRV-XJ5ΔgE/gI/TK毒株、Zhao等[100]构建的PRV-NYΔgE/gI/TK株。此外,虽然TK几乎不影响病毒的复制,但能参与PRV在潜伏期的重新激活,也会影响PRV的神经侵袭能力[1,97]。TK缺失株可以在猪的三叉神经节建立潜伏感染,地塞米松可以激活野生型PRV造成的潜伏感染,但不能完全激活TK缺失株造成的潜伏感染[101-103]。而且缺失TK的PRV感染猪后,该突变株向中枢神经系统的迁移会显著减少[104],提示TK可以减弱PRV的神经侵袭能力。

2.4 pUL41的生物学功能

UL41基因是PRV复制的非必需基因,UL41基因编码的pUL41又被称为宿主关闭蛋白 (virion host shutoff protein, vhs),pUL41在体内外均具有核糖核酸酶活性,可降解宿主细胞的mRNA,抑制宿主基因表达。在HSV-1和PRV中,pUL41通过在感染早期降解宿主mRNA和在感染后期降解病毒mRNA来抑制蛋白质表达,导致宿主的应答关闭[105-106]。与HSV-1不同的是,PRV中的pUL41还可以靶向rRNA进行降解[107]。宿主关闭蛋白vhs也可以影响TNF-α等宿主抗病毒的关键蛋白的编码,缺失UL41的PRV在Vero细胞中表现出较低的病毒滴度,感染缺失病毒的小鼠脾中TNF-α表达量升高,说明pUL41可能通过抑制TNF-α的表达促进病毒感染[108]。本课题组成员前期研究发现pUL41对PRV的复制不是必需的,但缺失UL41基因的PRV仍会减弱PRV在体内外的复制和感染能力,在体内试验中发现,相较于接种亲本PRV毒株或UL41回补病毒的小鼠,接种UL41缺失株的小鼠的感染进程有一定程度的延迟,且缺失UL41的PRV在小鼠三叉神经节中的复制和感染受到显著抑制[109]。

2.5 pUL46、pUL47、pUL48和pUL49的生物学功能

UL46是PRV的晚期基因,编码一个95 ku的蛋白,主要在病毒感染后期发挥作用。研究发现,UL46的缺失不影响病毒滴度,也不影响病毒粒子形态,只是病毒蚀斑大小有所降低,表明UL46对病毒复制不起决定性作用[110]。在感染后期的胞质中可检测到UL46产物(VP11/12),进一步研究发现VP11/12可作为一种穿梭蛋白同时定位在细胞核和细胞质内,并可与EP0、pUL48以及STING发生相互作用,而且pUL46的核定位信号是与pUL48互作的重要部位[111-112]。此外,VP11/12能够诱导细胞外调节激酶1/2 (ERK1/2) 的磷酸化,从而刺激ERK1/2信号通路,并促进核膜崩解,但不能激活PI3K-Akt途径[113]。PRVUL47基因编码一个97 ku的蛋白质pUL47(VP13/14),其构成病毒内膜的主要组成部分。研究表明UL47产物在细胞质中呈弥散状而在细胞核中成斑点状分布。缺失UL47基因的PRV病毒滴度与野生株相比下降将近10倍,病毒蚀斑也相应变小,而且胞质内由不完全内膜覆盖的病毒衣壳明显增多,表明UL47在维持病毒基本形态及病毒粒子的组装过程中发挥重要作用[110]。

PRVUL48基因编码的蛋白可在病毒感染的细胞或纯化的病毒粒子中检测到,大小为53～57 ku。免疫荧光研究表明,PRV pUL48蛋白主要定位于感染细胞的细胞质,但也在细胞核中出现。此外,它是细胞外病毒颗粒的组成部分,不存在于初级有包膜的核周病毒颗粒中。UL48缺失的PRV感染细胞后形成的空斑大小明显变小,增殖减慢,病毒滴度显著降低;UL48基因缺失最显著的影响是会使病毒粒子形态产生严重缺陷,UL48缺失株感染细胞后,可在电镜下观察到新形成的核衣壳滞留在宿主细胞质中,胞质内或胞外包膜完整的病毒颗粒很少;相反,无衣壳的粒子被大量产生和释放。这些发现表明pUL48蛋白在病毒粒子形成过程中可以促进核衣壳与后续的二次包膜有关的内膜蛋白的组装,在维持病毒粒子形态的完整性中起着重要作用[114]。除了能确保病毒粒子的结构完整性外,HSV-1的内膜蛋白pUL48还可以在进入细胞后和病毒蛋白从头合成之前在细胞内执行一系列功能。例如,即刻早期基因的转录就依赖宿主细胞因子HCF-1和OCT-1以及内膜蛋白pUL48之间形成的转录复合体来进行激活[115-117]。

UL49基因所编码的内膜蛋白VP22对病毒复制的影响很小,UL49的缺失对病毒的成熟、出核以及二次包膜几乎没有影响[10]。VP22的C端可与gE、gM的胞质结构域相互作用,是gE、gM定位所必须的,缺失gE、gM的病毒突变体无法掺入UL49编码的VP22蛋白[118]。研究表明PRV VP22蛋白有三种不同的亚型,主要亚型不发生磷酸化并存在于病毒粒子中,而其他两种类型被磷酸化且不存在于病毒粒子中。VP22在感染后6 h定位于细胞核内,其在细胞核内的免疫荧光呈点状弥漫性分布。点状细胞核定位是其最明显的染色形式,并不是只定位于病毒DNA复制的位点。缺失UL49的突变体在感染细胞中的复制与野生型病毒没有明显差异,感染小鼠后所表现出的毒力和神经侵袭性也与野生型病毒几乎没有差别[119]。

与核心基因不同,目前并没有相关报道表明非核心基因普遍存在于所有疱疹病毒中,同时非核心基因也并不像核心基因一样高度保守[8],US2、US3、UL23、UL41、UL46、UL47、UL48、UL49是存在于PRV中的非核心基因,编码pUS2、pUS3、TK、pUL41、pUL46 (VP11/12)、pUL47 (VP13/14)、pUL48 (VP16)、pUL49 (VP22)这几种内膜蛋白(表2)。非核心基因编码的内膜蛋白功能主要集中在影响病毒组装和宿主先天免疫方面,其中pUL47、pUL48、pUL49在维持病毒粒子完整性,在参与病毒粒子组装等过程中发挥一定作用;TK是PRV重要的毒力因子,影响PRV的潜伏感染和神经侵袭过程;pUS3则会影响病毒出核以及逆行运输;同时pUS2、pUS3、pUL41、pUL46通过不同的机制帮助病毒抵御宿主天然免疫,影响宿主的免疫应答。

表2 非核心基因编码的内膜蛋白生物学功能

3 小结与展望

PRV作为一种疱疹病毒编码近百种蛋白,分别构成了衣壳、囊膜和内膜。由于囊膜糖蛋白主要位于病毒表面,并具有良好的抗原性,长期以来,科研人员主要针对PRV的糖蛋白开展基础和应用研究,对糖蛋白在PRV感染中的功能和作用有了较深入了解,并研发了敲除糖蛋白gE或gI的基因工程疫苗。但是,近年相关研究表明,内膜蛋白作为疱疹病毒粒子的重要组成部分,在维持病毒形态结构的稳定、促进病毒的复制、出核以及二次包膜、以及对抗宿主免疫系统等方面也可发挥重要的作用。

本文通过对PRV的核心基因与非核心基因编码的内膜蛋白生物学功能进行归纳总结,发现核心基因编码的内膜蛋白在病毒的组装、神经元中的逆行运输、病毒的出核、二次包膜以及调控宿主的天然免疫方面有较大影响;而非核心基因编码的内膜蛋白则主要影响病毒的组装和宿主先天免疫应答。由此可见,核心与非核心基因编码的内膜蛋白在PRV感染宿主的基本过程以及逃逸和适应宿主免疫过程中均扮演重要角色,相关研究有望为未来PRV新型疫苗研发、靶向治疗性药物研究和潜伏感染机制等方面研究提供新的思路。

此外,PRV作为甲型疱疹病毒分子生物学研究中的一种模式病毒,对其内膜蛋白生物学功能的系统研究将有助于对整个甲型疱疹病毒科的内膜蛋白进行系统的功能分析,并进一步回答有关病毒生命周期、传播方式以及病毒发病机制等关键问题,这些研究有望在疱疹病毒的诊断检测、疫苗研发以及靶向性抗病毒药物研发等方向进行应用。