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肉豆蔻曲代替麸煨肉豆蔻组成方新二神丸的止泻作用研究

2024-04-02范蒙蒙张雨李红伟张振凌李凯

中国实验动物学报 2024年1期
关键词:肉豆蔻补骨脂肾阳虚

范蒙蒙张雨李红伟张振凌李凯∗

(1. 河南中医药大学,郑州 450046;2. 河南省中药特色炮制技术工程研究中心,郑州 450046;3. 国家中医药管理局中药炮制传承基地,郑州 450046)

曲类中药多具有消导之功,可健脾消食,促进胃肠运动,《本草经疏》中有类似记载:“古人用曲,即造酒之曲,其气味甘温,性专消导,行脾胃滞气,散脏腑风冷”。 中药发酵是借助微生物的自身代谢,对原药材中化学成分进行分解、加工、结构修饰,达到“增效”和“减毒”的目的,可对中药的药性以及药理作用产生影响[1-3]。 有研究表明,附子经发酵后,生物碱含量显著降低;黄芪发酵产物的总黄酮含量、体外抗氧化和降糖作用显著增强;固态发酵葛根渣比直接醇提葛根渣获得的葛根素含量提高了74.8%,发酵技术的应用为中药创新发展提供了广阔空间[4-10]。

肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragransHoutt.的干燥种仁[11],其味辛,性温,归脾、胃、大肠经,具有温中行气、涩肠止泻的功效,临床可用于治疗脾胃虚寒、久泻不止、脘腹胀痛、食少呕吐。 已有研究表明,麸煨肉豆蔻和盐补骨脂配伍组成的二神丸对脾肾阳虚泄泻模型有较好的干预效果[12-15]。 肉豆蔻生品中含有大量挥发油,有滑肠之弊,煨制后,挥发油含量显著降低,其止泻成分甲基丁香酚、甲基异丁香酚含量升高,毒性成分肉豆蔻醚、黄樟醚含量降低[16],故临床多用其炮制品,但大剂量地使用煨肉豆蔻亦可能有产生毒性的风险,因此开发可替代麸煨肉豆蔻的新饮片具有重要意义。本研究受“曲类中药多具有消导之功,可健脾消食”的启发,制备肉豆蔻曲,探讨肉豆蔻曲及其配伍组成二神丸能否对脾肾阳虚泄泻起到良好的干预效果,并采用16S rDNA 测序技术,探讨其作用机制,为新饮片的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

70 只清洁级雄性KM 小鼠,4 周龄,体重18 ~22 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2019-0008】,饲养于河南中医药大学动物实验室【SYXK(豫)2021-0015】,自由饮食饮水,提供12 h 光照与12 h 黑暗昼夜光照变化周期,室温20 ~25 ℃,相对湿度40% ~65%,饲养环境清洁卫生。 严格遵循实验动物使用的3R 原则,所有操作均符合河南中医药大学动物实验伦理学要求(DWLLGZR202202193)。

1.1.2 药物

肉豆蔻(211201,安徽惠丰国药有限公司)、补骨脂(211001,安徽惠丰国药有限公司)、番泻叶(皖20210456,安徽康和中药科技有限公司)。

1.1.3 主要试剂与仪器

氢化可的松注射液(2106203,国药集团容生制药有限公司);MTL、GAS、CORT、TSH、T、TNF-α、IL-1β 酶联免疫检测试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司(202302)。 恒温恒湿培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);HWL-125 型电热恒温干燥箱(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司);TGL-16M 型高速冷冻离心机(常州金坛良友仪器有限公司);EPOCH2NSC-SN 酶标仪(美国Agilent 公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

(1)肉豆蔻曲:取肉豆蔻粉末(5 号筛)80 g、麦麸13 g、面粉8 g,将面粉加蒸馏水100 mL 加热制成稀糊,冷却至室温,与上述药粉揉和均匀,以手捏成团,掷之即散为宜,捏制成方块,放入恒温恒湿培养箱(温度:32 ℃,湿度:85% ~90%)内发酵48 h,发酵完成后于50 ℃恒温干燥箱干燥24 h,即得。

(2)麸煨肉豆蔻、盐补骨脂:按照《中国药典》(2020 版)相关项下方法制备。

(3)药物混悬液的制备: ①二神丸混悬液:将3 种组合中的补骨脂和肉豆蔻按2 ∶1配比,粉碎成细粉,加蒸馏水均匀混合配制成0.24 g/mL 的混悬液,备用。 ②盐补骨脂、肉豆蔻曲混悬液:取盐补骨脂、肉豆蔻曲适量,粉碎成细粉,加蒸馏水均匀混合配制成0.24 g/mL 的混悬液,备用。 ③二神丸Ⅰ组为盐补骨脂+麸煨肉豆蔻;二神丸Ⅱ组为盐补骨脂+肉豆蔻曲;二神丸Ⅲ组为盐补骨脂+肉豆蔻生品。④番泻叶水煎液的制备:取适量番泻叶,浸泡1 h,加水煮沸30 min,过滤,减压浓缩成0.5 g/mL 的药液,备用。

1.2.2 分组、造模及给药

取70 只雄性健康KM 小鼠,适应性喂养3 d,随机分为7 组(正常组、模型组、二神丸Ⅰ组、二神丸Ⅱ组、二神丸Ⅲ组、盐补骨脂组和肉豆蔻曲组)。 除正常组,各组小鼠每天按0.1 mL/10 g 体重颈部皮下注射氢化可的松注射液,连续7 d,致肾阳虚,从第8 天开始,停止给予氢化可的松注射液,上午用番泻叶水煎液(0.2 mL/10 g)连续灌胃至第17 天,致脾阳虚,正常组给予同等体积生理盐水。 除正常组和模型组,其余各给药组从第8 天开始,每天下午灌胃给药,连续给药10 d,各给药组分别按0.2 mL/10 g体重灌胃给药,正常组和模型组给予同等体积的生理盐水。

1.2.3 一般行为学观察

每天观察记录小鼠的一般状态。

1.2.4 脏器指数检测

小鼠麻醉处死后,迅速摘取脾、胸腺、肾、睾丸、肾上腺等脏器,去除多余结缔组织,称定重量,计算脏器指数(脏器指数=器官重量/体重× 100%)。

1.2.5 病理组织学检查

将脾、肾、睾丸等脏器,用生理盐水冲洗,组织固定液固定,乙醇逐级脱水,常规石蜡包埋,切片,以苏木精-伊红染色并在显微镜下观察。

1.2.6 生化指标测定

小鼠麻醉后取血,分离血清,ELISA 法检测血清中MTL、GAS、CORT、TSH、T、TNF-α、IL-1β 水平。

1.2.7 小肠推进率、胃残留率

末次给药前禁食12 h,自由饮水。 末次给药后1 h,灌胃炭末糊(5%活性炭)每只2 mL。 求得小肠推进率及胃残留率[17](小肠推进率=(炭末在小肠推进距离/小肠全长) × 100%、胃残留率=(胃全-胃净)/灌胃量× 100%)。

1.2.8 肠道菌群检测

小鼠取血后迅速开腹,取出肠组织,收集肠内容物,放入无菌冻存管,置于-80 ℃超低温冰箱保存,以待后续进行16S rDNA 测序。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 进行统计分析,数据以平均值± 标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用最小显著性差异法(LSD)检验,P<0.05 表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般行为学观察

造模前,所有组小鼠精神状态良好,毛发洁白有光泽,粪便呈颗粒状。 造模3 d 后,除正常组外,小鼠活动量减少,毛色暗黄,大便稀软;7 d 后模型组小鼠体型逐渐消瘦,毛发枯糙,出现拱背卷曲、排水样便、肛周污秽等情况;给药后,各给药组小鼠状况均出现不同程度好转。

2.2 脏器指数

由表1 可知,模型组各脏器指数显著低于正常组,说明造模后各脏器均发生不同程度病变;各给药组小鼠脏器指数较模型组出现不同程度升高,其中二神丸Ⅱ组对脾肾阳虚泄泻小鼠脏器指数的干预效果优于其他给药组。

表1 各组小鼠脾、肾、肾上腺、胸腺、睾丸的脏器指数(± s,n =10)Table 1 Organ index of spleen, kidney, adrenal gland, thymus gland, and testis in each group of mice (± s,n =10)

表1 各组小鼠脾、肾、肾上腺、胸腺、睾丸的脏器指数(± s,n =10)Table 1 Organ index of spleen, kidney, adrenal gland, thymus gland, and testis in each group of mice (± s,n =10)

注:与正常组相比,∗∗P <0.01;与模型组相比,#P <0.05,##P <0.01;与二神丸Ⅰ组相比,&P <0.05,&&P <0.01。 (下表同)Note. Compared with normal group, ∗∗P <0.01. Compared with model group, #P <0.05, ##P <0.01. Compared with ershen pills Ⅰgroup, &P <0.05, &&P <0.01. (The same in the following tables)

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2.3 病理组织学检查

如图1 所示,肾组织切片中:与正常组相比,模型组小鼠肾小球萎缩,肾小囊体积变大,肾小管出现空泡,细胞形态发生改变,各给药组出现不同程度好转,其中二神丸Ⅰ、Ⅱ组对肾小球形态的改善效果最明显,二神丸Ⅱ组肾小管的破坏明显减轻;睾丸组织切片中,正常组小鼠生精细胞排列整齐,基底膜完整,精原细胞排列整齐,精子数量丰富,模型组小鼠生精细胞形态发生改变,基底膜受损,精原细胞紊乱,未见成熟的精子,各给药组中以二神丸Ⅰ、Ⅱ组对睾丸组织的恢复效果最佳;脾组织切片中:与正常组相比,模型组小鼠白髓萎缩,白髓中淋巴细胞明显减少,白髓与红髓交界的边缘区模糊,各给药组淋巴细胞出现不同程度的增多。

图1 各组小鼠病理组织的HE 染色切片Note. Red arrow. Glomerulus. Green arrow. Renal tubules. Blue arrow. Basement membrane. Yellow arrow. Spermatogenic cells. Black arrow. Sperm. Orange. Lymphocytes.Figure 1 HE staining sections of pathological tissues in each group of mice

2.4 血清生化指标检测

与正常组相比,模型组小鼠胃肠激素相关血清指标GAS 水平下降、MTL 水平上升;肾功能相关指标CORT、TSH、T 水平均下降;炎症因子相关指标TNF-α、IL-β 水平均上升,给药后,血清各指标水平均有不同程度改善,二神丸Ⅰ、Ⅱ组对血清相关指标的干预效果优于其他给药组,且两组之间无明显差异,说明二神丸Ⅰ、Ⅱ组对脾肾阳虚泄泻模型小鼠的血清生化指标均有显著的改善效果,见表2。

表2 各组小鼠血清相关指标检测(± s,n =10)Table 2 Detection of serum related indicators in each group of mice(± s,n =10)

表2 各组小鼠血清相关指标检测(± s,n =10)Table 2 Detection of serum related indicators in each group of mice(± s,n =10)

注:与正常组相比, ∗P <0.05。Note. Compared with normal group, ∗P <0.05.

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2.5 对小肠推进及胃排空的影响

与正常组相比,模型组小鼠小肠推进率显著升高、胃残留率降低,各给药组小鼠小肠推进率水平低于模型组,二神丸Ⅰ、Ⅱ组以及肉豆蔻曲组胃残留率显著升高。 实验结果见表3,说明二神丸Ⅰ、Ⅱ组对脾肾阳虚泄泻模型小鼠胃肠功能的干预效果优于其他组,且二神丸Ⅱ组效果更佳,二神丸Ⅲ组与盐补骨脂组对小肠功能的干预作用更强,但其显著低于正常水平,可能引发胃肠道副作用。

表3 各组小鼠小肠推进率和胃残留率(± s,n =10)Table 3 Small intestine propulsion rate and gastric residue rate of mice in each group(± s,n =10)

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2.6 肠道菌群结果

2.6.1 各组小鼠肠道菌群OTU 聚类分析结果

以97%的一致性将序列聚类成为OTUs(见图2),7 组小鼠肠道菌群检测共检出3083 个OTU,组间共有OTU 为45 个,与正常组相比,模型组OTU明显降低,与模型组相比,各给药组OTU 出现不同程度升高,说明脾肾阳虚泄泻模型会降低小鼠肠道菌群多样性,给药后物种多样性得到改善,二神丸Ⅱ组对肠道菌群的改善作用优于二神丸Ⅰ组。

图2 各组小鼠肠道菌群OTU 聚类分析结果Note. A. Normal group. B. Ershen pills I group. C. Ershen pills Ⅱgroup. D. Ershen pills III group. E. Salt psoralen group. F.Nutmeg koji group. G. Model group.Figure 2 OTU cluster analysis results of gut microbiota in each group of mice

2.6.2 α 多样性与β 多样性分析

α 多样性指数反映样本内物种多样性,由图3可知,与正常组相比,模型组Shannon、Simpson、ACE、Chao1 指数均明显降低,与模型组比较,二神丸Ⅰ、Ⅱ组与肉豆蔻曲组各指标明显上升,组间比较未见显著性差异(P>0.05)。

图3 各组小鼠肠道菌群箱线图Figure 3 Box plot of gut microbiota in each group of mice

β 多样性反映不同组间的群落多样性,主要用于样本组间差异的比较,样本距离越近,表示物种组成结构越相似。 由图4 可知,不同组样本在群落结构及组成上和模型组之间的存在差异。

图4 基于weighted unifrac 算法的PCoA 图Figure 4 PCoA diagram based on weighted unifrac algorithm

2.6.3 各组小鼠肠道菌群物种组成差异分析

如图5 所示,在科水平上,正常组优势物种普雷沃 菌 科 ( Prevotellaceae ) 和 毛 螺 菌 科(Lachnospiraceae) 相对丰度分别为23.70% 和18.59%,模型组显著降低,给药后,二神丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、盐补骨脂组、肉豆蔻曲组在Prevotellaceae 水平上相对丰度分别为9.66%、 12.90%、 13.87%、4.89%、4.93%,在Lachnospiraceae 水平上相对丰度分别为9.80%、11.82%、0.85%、7.70%、8.47%,其中二神丸Ⅱ组与二神丸Ⅰ组提高二者物种相对丰度的程度相当;模型组在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)占比10.70%,正常组占比0.07%,给药治疗后,各组水平较模型组显著降低,占比分别为2.88%、3.36%、13.99%、0.89%、4.66%,二神丸Ⅱ组与二神丸Ⅰ组下调趋势相当,盐补骨脂组效果最显著。

图5 各组小鼠肠道菌群结构分析Figure 5 Analysis of gut microbiota structure in each group of mice

在属水平上,模型组在拟杆菌属(Bacteroides)占比较高,为32.86%,正常组占比为12.10%,给药后,二神丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、盐补骨脂组、肉豆蔻曲组占比分别为 18.69%、 17.85%、 19.20%、 21.47%、20.76%,埃希氏-志贺菌属(Escherichia-Shigella)在模型组中的相对丰度(10.69%)显著高于正常组(0.03%),治疗后,各给药组占比分别为2.77%、0.31%、13.19%、0.51%、0.13%,二神丸Ⅱ组与肉豆蔻曲组能显著下调Escherichia-Shigella 相对丰度。

3 讨论

MTL 和GAS 是重要的胃肠激素,其中MTL 能够作用于消化道平滑肌细胞上的受体,促进胃肠运动和胃肠道对水、电解质的运输[18]。 GAS 可刺激消化腺分泌,促进食管和胃的括约肌及消化道平滑肌的收缩,加强胃肠道运动[19]。 CORT、TSH、T 均为评价肾功能状态的重要指标[20],作为下丘脑-垂体-肾上腺轴、下丘脑-垂体-甲状腺轴、下丘脑-垂体-性腺轴相关激素指标,在机体受到应激时,可引发轴功能紊乱,引发机体产生一系列的肾阳虚症状。 脾虚常常伴随炎症的产生,TNF-α 和IL-1β 是炎症产生时重要的细胞因子,TNF-α 主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生,TNF-α 为促炎因子,可诱导其他炎症因子IL-1β 的产生[21]。 本实验选取以上血清相关指标探讨二神丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组以及盐补骨脂、肉豆蔻曲在治疗脾肾阳虚泄泻中的作用效果,结果显示各给药组对脾肾阳虚泄泻小鼠模型具有不同程度的改善,且二神丸Ⅱ组能达到二神丸Ⅰ组的改善水平。

肠道菌群是寄生在胃肠道内的众多微生物的统称,随着对肠道菌群的深入研究,中药通过调节微生态治疗腹泻性疾病的作用机制越来越明确。有研究表明,黄芩汤可降低溃疡性结肠炎小鼠大肠杆菌志贺菌属(Escherichia-Shigella)、毛螺菌属NK4A136(Lachnospiraceae-NK4A13-group)、肠杆菌属(Enterorhabdus)相对丰度[22-23],金晶等[24]在研究四神丸、二神丸及五味子散对结肠炎小鼠肠道菌群实验中发现,致病菌拟杆菌属(Bacteroides)、断链真杆菌(Eubacterium-fissicatena)和毛螺菌科UCG-006(Lachnospiraceae-UCG-006)等相对丰度降低,毛螺菌科NK4A136(Lachnospiraceae-NK4A136)、木犀草科(Muribaculaceae)和阿克曼菌属(Akkermansia)菌群的相对丰度增加;二神丸可上调大鼠普雷沃菌属(Prevotellaceae),降低变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)等群落水平的物种多样性来治疗腹泻型肠易激综合征[25]。 本研究对各组小鼠肠道菌群进行高通量测序,发现模型组小鼠的肠道菌群物种丰富度显著降低, 拟杆菌属(Bacteroides)、 埃希氏-志贺菌属( Escherichia-Shigella)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)丰度增加,普雷沃菌科 ( Prevotellaceae ) 和毛螺菌科(Lachnospiraceae)丰度降低,Escherichia-Shigella 和Enterobacteriaceae 是与泄泻疾病相关的致病菌[26],给药治疗后,各给药组小鼠肠道菌群水平得到不同程度改善,二神丸Ⅰ、Ⅱ组优于其他给药组,且两组之间无显著性差异。 本实验证明肉豆蔻曲及其配伍组成二神丸可改善脾肾阳虚泄泻模型导致的菌群失调, 降低致病菌 Bacteroides、 Escherichia-Shigella、 Enterobacteriaceae 丰度, 增加有益菌Prevotellaceae、Lachnospiraceae 丰度,发挥治疗作用。

本研究创新性地以肉豆蔻为发酵原料,采用自然发酵法对其进行炮制,制得肉豆蔻曲,代替麸煨肉豆蔻并对组方新二神丸的药理作用进行探究,发现其在减少肉豆蔻用量的情况下,与盐补骨脂配伍使用对脾肾阳虚泄泻小鼠也可达到良好的效果,减少了肉豆蔻的使用量,降低了中毒的风险。

综上所述,肉豆蔻曲配伍使用对脾肾阳虚泄泻模型的作用效果显著,与生品相比,其温脾止泻作用增强,本研究初步探索了肉豆蔻曲配伍组成二神丸的作用机制,建立了肉豆蔻曲的炮制方法,为创新饮片的研究提供了参考。

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