基于稳定同位素的水生生物食物链结构特征分析

张耀方，李添雨，李卓轩,2，叶芝菡，薛万来，黄炳彬，李 垒*，张天娇,3，董 澜,3

1. 北京市水科学技术研究院，流域水环境与生态技术北京市重点实验室，北京 100048

2. 北京交通大学，北京 100044

3. 北京林业大学，北京 100091

北京河湖水系受自然地理特征、生态补水、人为活动等不同程度的影响，水生生物食物链结构差异较大，明晰其差异性、识别存在的问题对未来水生态系统保护修复至关重要[1]. 但目前对水生生物的分析重点围绕多样性方面[2]，评价结果无法进一步反映水生生物食物链的组成、结构和功能，难以反映水生态系统的物质循环和能量传递过程. 有研究[3-9]表明，水生生物摄食过程中碳、氮稳定同位素比率会因新陈代谢富集产生变化，δ13C、δ15N 在食物链上每传递一级分别富集0～1‰、3‰～4‰，常用这两种同位素比率变化追溯水生生物摄食食源组成、贡献、营养水平.有学者利用水生生物碳、氮同位素差异，并结合经验和数理统计方式，开展水生生物营养谱构建、摄食关系定量[8-11]；此外，不少学者利用δ13C-δ15N 散点图探讨水生生物的生态位宽和重叠程度，反映水生生物摄食关系[3,12-13]. 基于此，本研究选取北京市潮白河流域、永定河流域、北运河流域三大不同人为影响、不同水源条件的流域[14-16]，山区、平原不同地理条件河段作为研究区域，食物链不同营养级水生生物为研究对象，依托碳、氮稳定同位素结果并耦合贝叶斯模型，定量分析评价不同流域水生生物碳、氮稳定同位素的差异、摄食关系、食物网结构，以期为后续水生态系统状况综合评价、增殖放流、生物操控等水生态保护修复对策提供科学指导.

1 材料与方法

1.1 研究区域

样品采集于北京北运河流域的清河、凉水河等水体〔以再生水为主，水深1～2 m，流速＜0.3 m/s，水质总体稳定在Ⅳ～Ⅴ类(GB 3838-2002《地表水环境质量标准》)〕，潮白河流域的潮河、白河等水体(以天然径流为主，水深0.2～1 m，流速0.3～0.8 m/s，水质总体稳定在Ⅱ～Ⅲ类)，以及永定河流域的永定河(以天然径流及外调黄河水为主，水深0.5～2 m，流速0.3～1.2 m/s，水质总体稳定在Ⅲ～Ⅳ类)，采样时间为2022 年8 月(夏季)，共布设30 个采样点(见图1).

图1 北京地区不同流域河道采样点分布Fig.1 River sampling sites in different watersheds in Beijing

1.2 样品采集

采集水样测定主要水质指标，并采集水生植物、浮游植物、浮游动物、底栖动物、鱼类等水生生物样品，水生生物样品采集方法参照《水生生物调查技术规范》(DB11/T 1721-2020)[17]. 有机碎屑采用直径为25 mm 的Whatman GF/F 玻璃纤维滤膜对水样进行预处理，将滤膜放入铝盒，于马弗炉中450 ℃灼烧3 h，以去除有机物，滤膜冷却后放入1 mol/L 的浓盐酸中酸化24 h，然后在烘箱中60 ℃下恒温烘干48 h；水生植物取组织样品，用剪子剪碎后冷干24 h 后取出捣碎密封；浮游植物用100 μm 筛绢过滤取其滤液，浮游动物取其留在筛绢上的组织样品，蒸馏水清养3 h，分别抽滤至两张GF/C 滤膜上，置于60 ℃下低温烘干(36～48 h)，刮下其组织样品；底栖动物按照摄食类型捕食者、钻食者、刮食者、牧食者、滤食者[5]分类取其组织样品、鱼类按照种分别取其组织样品，冷干24 h 后取出捣碎密封[18-21]. 前处理后用于测定稳定同位素.

1.3 分析方法

1.3.1 稳定同位素测试

将制备好的样品放入稳定同位素比质谱仪(MAT253，赛默飞世尔科技公司，美国)进行碳、氮同位素(δ13C、δ15N)的测定，分析所采用的参照物质分别是V-PDB(Pee Dee Belemnite)和空气中的氮气，标准物质分别为国际通用的IAEA-CH-6 和IAEA-N-1. 为保证实验结果的精确度和准确性，每10 个样品进行重复测定，碳、氮稳定同位素比值的分析精度均为0.2‰. 结果采用三点校正，即用USGS62(δ13CPDB=-14.79‰，δ15Nair=20.17 ‰)、USGS40(δ13CPDB=- 26.389 ‰，δ15Nair=-4.52 ‰)和UREA(δ13CPDB=- 37.02 ‰，δ15Nair=-2.91‰)对碳氮同位素测定结果进行校正. δ13C 或δ15N 比值计算公式如下：

式中，R代表δ13C 或δ15N 比值， Xsample、Xstandard分别代表样品和标准物质中的δ13C 或δ15N[6].

1.3.2 环境因子测定

在实验室参照HJ 636-2012《水质 总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》、GB/T 11893-1989《水质 总磷的测定 钼酸铵分光光度法》、HJ 535-2009《水质 氨氮的测定 纳氏试剂分光光度法》、HJ 828-2017《水质 化学需氧量的测定 重铬酸盐法》、HJ 897-2017《水质 叶绿素a 的测定 分光光度法》国家/行业标准分别测定总氮(TN)、总磷(TP)、氨氮(NH3-N)、化学需氧量(CODCr)、叶绿素a(Chla)浓度.

1.4 数据分析

1.4.1 碳、氮同位素重叠分析

采用Python 编写代码，以δ13C 作为横坐标、δ15N作为纵坐标，按照水生生物类型分类绘制散点图，将散点分布范围以矩形方式进行连接，并计算不同类型水生生物之间的重叠区域.

1.4.2 营养级计算

营养级计算公式如下：

式中：以浮游动物作为基本线，δ15Nsample代表样品的氮同位素比值；δ15Nbaseline代表基准生物氮同位素比值；Δδ15N代表氮富集因子，该研究取3.4‰[6,22].

1.4.3 摄食比例分析

通过文献查阅、经验以及碳、氮同位素营养级分析，确定水生生物可能的摄食饵料，而后使用R 语言中的“MixSIAR”工具包，以摄食饵料作为解释变量，以δ13C、δ15N 值作为响应变量，输入消费者和潜在摄食饵料的碳、氮同位素比值，构建贝叶斯模型，推算摄食饵料中各种饵料的贡献比值[18-20,23-27]. 对于消费者M的同位素特征δM如下：

式中：n为消费者M对应的饵料种类数；fi为第i个食物源对混合物的贡献比例；δi为第i个食物源的稳定同位素与特征；γi为第i个食物源的同位素特异性分馏值，其中氮同位素取3.4‰，碳同位素取1.3‰[27].

1.4.4 环境因子影响分析

利用Origin 软件进行不同类型河道TN、TP、NH3-N、CODCr、Chla 与水生生物碳、氮稳定同位素之间的Pearson 相关性分析.

2 结果与分析

2.1 不同流域河道碳、氮同位素特征

潮白河流域山区河道、永定河流域山区河道、永定河流域平原河道和北运河流域平原河道水生生物种群组成差异较大，其水生生物优势种以狐尾藻、菹草和金鱼藻为主，盖度分别为50%、60%、30%和80%；浮游植物优势类群以硅藻和蓝藻为主，总密度依次为173×104、39×104、1 238×104和6 714×104cells/L；浮游动物优势类群以轮虫、桡足类为主，总密度依次为8、2.9、144、10 μg/L；底栖动物优势类群分别依次为清洁种、清洁种、清洁种-中污种、耐污种；鱼类均以杂食性为主.

由图2 可知，水生生物δ15N 总体呈现鱼类＞底栖动物＞浮游动物、浮游植物及水生植物＞有机碎屑的特征，同一流域内鱼类、底栖动物与低营养级水生生物之间δ15N 差异显著，一般较之分别增加了73%～223%、49%～158%，低营养级水生生物之间δ15N 差异不显著. 不同流域不同水生生物δ15N 差异显著，其中永定河流域、潮白河流域河道鱼类δ15N 总体稳定在8‰～18‰之间，显著大于北运河流域δ15N(5‰～15‰)；底栖动物δ15N 呈现出相反的趋势，总体上北运河流域在8‰～15‰之间，大于永定河流域、潮白河流域(8‰～13‰)；浮游动物、浮游植物δ15N 呈现永定河流域、北运河流域总体大于潮白河流域的特征；水生植物δ15N 呈现永定河流域、潮白河流域山区河道大于北运河流域、永定河流域平原段的特征；有机碎屑δ15N 呈现永定河流域总体大于北运河流域、潮白河流域的特征.

图2 不同流域河道碳、氮同位素特征Fig.2 Carbon and nitrogen isotope characteristics of river channels in different watersheds

由水生生物δ13C 分布可知：δ13C 总体呈现有机碎屑＞浮游动物、浮游植物＞鱼类、底栖动物的特征，同一流域内除有机碎屑和水生植物外，水生生物δ13C总体差异不显著，均表现出较大程度的重合性，稳定在-27‰～-20‰之间. 不同流域之间水生生物δ13C 存在一定差异，永定河流域、潮白河流域有机碎屑与其余水生生物δ13C 差异极大，总体不存在重叠交叉区域，北运河流域则反之.

由δ15N、δ13C 区间分布矩形可知：不同流域δ15N、δ13C 呈现不同上升趋势，永定河流域、潮白河流域山区河道均总体呈现“L”型阶梯上升趋势，永定河流域平原河道呈现“ ”型上升趋势，北运河流域呈现“│”型上升趋势. 不同流域不同水生生物δ15N、δ13C 矩阵分布重叠情况也呈现显著差异性，永定河流域山区河道、永定河流域平原河道、潮白河流域山区河道和北运河流域平原河道中鱼与底栖动物重叠部分占比分别为51.18%、39.32%、25.76% 和47.96%，与浮游动物、浮游植物、水生植物重叠比例分别为9.26%、10.15%、0%和53.73%，北运河流域中鱼类与其他水生生物δ15N、δ13C 分布区间呈现大范围重叠.

2.2 不同流域水生生物营养级及摄食特征

由图3 可知，永定河流域山区河道、永定河流域平原河道、北运河流域平原河道和潮白河流域山区河道鱼类营养级平均值分别为2.57、2.79、2.38 和3.22；底栖动物营养级平均值分别为2.03、2.22、2.77和2.44；浮游动物营养级平均值分别为1.14、1.29、1.96 和0.95. 不同水生生物营养级总体呈现肉食性鱼类＞杂食性鱼类＞底栖捕食者＞底栖刮食者、滤食者、牧食者、钻石者＞浮游动物、浮游植物、水生植物的特征. 在空间尺度上，不同流域呈现出显著差异性，肉食性鱼类营养级呈现永定河流域、潮白河流域＞北运河流域的特征，杂食性鱼类呈现潮白河流域＞永定河流域＞北运河流域的特征，底栖动物及浮游动物、浮游植物营养级总体呈现北运河流域＞潮白河流域、永定河流域的特征，北运河流域出现营养级“倒挂”现象.

图3 不同流域同类型水生生物营养级特征Fig.3 Trophic level characteristics of homogeneous aquatic organisms in different watersheds

由图4 可知，同一种鱼类在不同流域摄食偏好上总体表现出一致性，但具体的摄食比例上表现出显著差异性：肉食性鱼类红鳍原鲌在不同流域对水生生物的摄食比例不同，但均以摄食鱼类为主，摄食比例为60%～82%，其次为底栖动物，摄食比例为15%～32%；马口鱼也呈现出相同的趋势. 棒花鱼、麦穗鱼等杂食性鱼类在不同流域对底栖动物、浮游动物、浮游植物、水生植物等摄食偏好上总体体现出一致性. 除北运河流域以外，其余流域河道杂食性鱼类对底栖动物摄食比例总体在50%以上（尤其以捕食者及牧食者为主），而对水生植物、浮游植物的摄食比例远小于北运河流域. 底栖动物在不同流域其偏好性总体保持一致，但是摄食比例上有一定差异，刮食、滤食、牧食类底栖动物以水生植物、浮游植物、浮游动物为主，摄食比例在80%左右；底栖捕食者以底栖牧食者为主要饵料，为30%～70%；底栖捕食者以底栖刮食者为主要饵料，摄食比例在40%左右.

图4 不同流域水生生物摄食比例Fig.4 Feeding ratios of aquatic organisms in different watersheds

2.3 水生生物稳定同位素与环境因子相关关系

对TN、TP、NH3-N、CODCr、Chla 浓度与不同水生生物δ13C、δ15N 进行Pearson 相关性分析，由表1可知，鱼类、底栖动物δ13C 与TN 浓度呈极显著负相关，与CODCr浓度呈极显著正相关，Pearson 相关系数绝对值在0.4～0.5；水生植物δ13C 与Chla 浓度呈极显著正相关，且Pearson 相关系数达到0.7. 由表2 可知，鱼类、有机碎屑δ15N 与TN 浓度呈极显著负相关，Pearson 相关系数绝对值约0.6；鱼类δ15N 与TP 浓度呈极显著负相关，Pearson 相关系数绝对值小于0.5；鱼类、浮游动物、浮游植物、有机碎屑δ15N 与CODCr浓度呈极显著负相关，其中有机碎屑δ15N 与CODCr浓度Pearson 相关系数绝对值达到0.73，其余Pearson相关系数均小于0.5.

表1 各环境因子与δ13C 的相关性分析Table 1 Correlation analysis of each environmental factor with δ13C

表2 各环境因子与δ15N 的相关性分析Table 2 Correlation analysis of each environmental factor with δ15N

3 讨论

3.1 不同营养级水生生物碳、氮同位素特征

不同类型水生生物化学元素总体稳态分布，该研究结果表明，在永定河流域、潮白河流域和北运河流域，不同空间纬度、较大地理和生态梯度的水体中，营养级总体均在0～4 级之间，δ13C 总体均分布在-30‰～-10‰之间，δ15N 总体均分布在0～18‰之间，这与大量研究认为消费者碳、氮同位素不易受温度等环境变化的影响，其自身化学成分含量及比例在自然界中总体具有化学计量稳态机制的结论[7]一致. 不同营养级水生生物总体呈现出δ15N 随着水生生物营养级增加而上升的趋势，δ13C 随着水生生物营养级增加而降低趋势，但δ13C 的变化显著小于δ15N 的变化，这与氮同位素特异性分馏值(3.4‰)大于碳同位素特异性分馏值(1.3‰)[27]表现出一致性.

高营养级水生生物δ15N、δ13C 形成的矩阵与低营养级水生生物δ15N、δ13C 形成的矩阵具有一定的重叠区间，鱼类δ15N、δ13C 形成的矩阵与浮游动物、浮游植物、水生植物δ15N、δ13C 形成的矩阵重叠比例呈现潮白河流域＜永定河流域山区河道、永定河流域平原河道＜北运河流域的特征，这反映了北运河流域消费者对浮游动、植物摄食较多. 有研究表明，摄食重叠程度随着资源可用程度和河流食物网冗余程度的增加而增加，在高度营养过剩的河流食物网中泛化种盛行，水生态系统内部消费者食谱变化可能很微小[23]，这与高营养盐的北运河流域食物网结构冗余、摄食结构较单一的现状相一致. 底栖动物、浮游动物δ15N、δ13C 与浮游植物δ15N、δ13C 矩阵之间重叠比例在不同流域间差异较小，低营养级水生生物δ15N、δ13C 总体与营养盐相关性弱，这与低营养级水生生物除受水环境影响外，同时易受生境、水流等影响有关；高营养级鱼类δ15N、δ13C 与TN、TP、CODCr均显著相关，且经过食物链传递、同位素的分馏，更能稳定反映不同水环境质量的差异性的研究结论[28-31]一致，采用鱼类δ15N、δ13C 矩阵与其余水生生物δ15N、δ13C 矩阵之间的差异能更有效地指示水体水生态系统结构、功能的差异.

3.2 不同流域水生生物食物链结构空间异质性

不同流域δ15N 随食物链传递呈现不同上升趋势，δ15N 在不同分布区域表现出较显著差异，永定河流域、潮白河流域δ15N 总体呈现显著的阶梯上升趋势，不同营养级之间δ15N 交叉较小，而北运河流域δ15N 呈现大范围叠加上升趋势. 不同流域高营养级消费者(鱼类)δ15N 呈显著差异，永定河流域山区河道、永定河流域平原河道、潮白河流域山区河道和北运河流域平原河道不同空间分布的鱼类δ15N 范围分别为7.55‰～17.93‰、10.53‰～16.35‰、7.72‰～15.33‰和5.47‰～15.40‰，平均值分别为13.03‰、13.21‰、11.98‰和9.15‰，潮白河及永定河流域河道鱼类δ15N 总体高于北运河流域河道，而底栖动物、浮游动物、浮游植物、水生植物则总体呈现相反趋势. 不同流域之间水生生物δ13C 存在一定差异，永定河流域、潮白河流域有机碎屑与其余水生生物δ13C 差异极大，北运河流域水生生物δ13C 总体重叠，且局部出现营养级“倒挂”现象.这些均反映了不同流域水生态系统中有机物在水生生物中循环路径的差异，从而导致水生生物食物链结构空间异质性.

分析上述空间异质性的原因：一方面，有学者认为水生生物δ15N 受不同水层氮交换程度的影响[32]，水生生物δ13C 组成与水深呈显著负相关[22,33]，不同空间纬度水温、流速、生境等差异也会导致不同流域水生生物物种组成、结构上有很大差异，从而碳、氮同位素差异很大[34]；另一方面，受人类活动影响也是其中一个关键要素，北运河流域污染负荷远大于潮白河流域和永定河流域，有研究表明受不同营养盐条件的影响，初级生产者无机碳和有机碳来源的差异随着食物链向上传递至底栖动物、鱼类，从而呈现出鱼类、底栖动物δ13C 的时空差异[7,34]，这也和研究结果中鱼类、底栖动物δ13C 与TN、CODCr浓度呈极显著相关相一致，同时人和动物产生的污水尤其是经过二次处理后的污水中δ15N(10‰～20‰)通常比本身生态系统高[35]，抬高了河道中水生植物、浮游动物、浮游植物、底栖动物的δ15N，水生生物种群间因营养位置引起的同位素组成差异，这与该研究中以再生水为主的北运河流域底栖动物、浮游动物、水生植物δ15N 总体大于其他流域表现一致；此外，受食源影响，北运河流域可摄食食物丰富，而潮白河流域、永定河流域食源相对较少，同种水生生物在不同区域摄食关系也表现出极大差异性，该研究中棒花鱼、麦穗鱼等杂食性鱼类在潮白河流域、永定河流域对底栖动物摄食比例远大于北运河流域，对水生植物、浮游植物的摄食比例远小于北运河流域，伴随着从低营养级向高营养级水生生物进行物质循环、能量传递过程，导致北运河流域鱼类δ15N 小于其他流域、δ13C 总体重叠，且营养级与浮游动物差异不大乃至“倒挂”.

3.3 稳定同位素技术在水生态保护修复中的应用

稳定同位素技术可以在较大尺度上对水生态系统中物质来源及迁移转化过程进行追踪分析，对反映水生态系统中物质循环、能量流动有着重要作用[3,7-8,36-37]. 该技术应用前景广阔：一是采用鱼类δ15N指示水生生物营养结构差异，该研究表明，鱼类δ15N总体稳定在5‰～18‰之间，与营养盐变化呈现显著相关性，能反映不同水环境特征差异，同时鱼类作为水生态系统中的高营养级消费者，生长周期长、同一类型水体中波动小，且鱼类δ15N 可以反映较长的摄食历史、完整的摄食过程，相对于初级生产者、低营养级消费者而言，可作为理想水生生物营养结构变化指示因子[3,28,34]；二是不同流域各类生物δ15N、δ13C 分布矩阵重叠度，可以很好地表征河流食物网冗余程度，通过食物网冗余程度分析可以更加直观反映水生态系统受可用资源的改变，其摄食行为的改变以及系统稳定性变化[23]，也可采用食物网冗余对象为参考指导水生态系统修复的方向；三是科学指导生物操控，结合贝叶斯模型可获取各类水生生物摄食矩阵，从而定量分析水生生物摄食食物及比例[36,38-39]，该研究结果表明营养级越高的生物摄食关系越复杂，偏好性越不显著，营养级相对较低的底栖动物、浮游动物偏好性较显著，在开展生物操控时，可因地制宜结合其本底水生生物特征、目标物种的摄食矩阵，并在此基础上利用稳定同位素的手段进一步分析不同季节生物摄食的差异性，投放适宜比例的摄食该类型的水生动物、营造其适宜的生境条件.

4 结论

a) 潮白河流域、永定河流域、北运河流域河道低营养级的浮游动植物由于受水动力、水生生境变化影响，波动较大，而高营养级的水生生物δ13C、δ15N能更好地指示水体水生态系统结构功能的变化，建议在进行水生生物食物网结构分析时可采用鱼类δ15N、高营养级水生生物与低营养级水生生物δ15N、δ13C分布矩阵重叠度表征水生生物食物网结构状况.

b) 不同流域河道水生生物碳、氮同位素具有空间异质性，永定河流域、潮白河流域δ15N 总体呈现显著的阶梯上升趋势，不同营养级之间δ15N 交叉较小，而北运河流域δ15N 呈现出大范围叠加上升趋势，此外，北运河流域鱼类δ15N 总体小于其他流域，而底栖动物、浮游动物、浮游植物、水生植物则总体呈现相反趋势. 不同流域鱼类δ15N、δ13C 形成的矩阵与浮游动物、浮游植物、水生植物δ15N、δ13C 形成的矩阵重叠比例呈现潮白河流域＜永定河流域山区河道、永定河流域平原河道＜北运河流域的特征，这反映了北运河流域浮游动物、浮游植物、水生植物的冗余程度较高.

c) 同一种鱼类在不同流域摄食关系上表现出显著差异性，肉食性鱼类等高营养级水生生物在不同流域均以摄食鱼类为主，摄食比例为60%～82%，但具体摄食差异较大，无明显偏好性；杂食性鱼类在不同流域对底栖动物、浮游动物、浮游植物、水生植物等摄食偏好上总体体现出一致性，对底栖动物摄食比例总体在50%以上，其中尤其以捕食者及牧食者为主；底栖动物在不同流域其偏好性总体保持一致，但是摄食比例上有一定差异. 在不同流域进行增殖放流、生物操控时应充分考虑其摄食偏好、调控重点对象、冗余的水生生物种群，以投放对应的底栖动物为主，适当配置鱼类.