LAMP技术特点及其用于肝炎病毒检测的相关研究进展

普彬，徐向红

1甘肃省人民医院中医二科，兰州 730000；2甘肃省临床医学转化研究所，兰州 730000

肝炎病毒为临床常见肝脏感染病原菌，感染后会造成肝脏炎性损伤、肝脏纤维化，并诱发肝脏细胞癌变，威胁患者生命安全，需尽早检出并积极抗病毒治疗，以促进患者肝脏功能恢复[1]。目前在对肝炎病毒诊断中，常见方法包括血清抗原-抗体特异性检测、聚合酶链式反应（PCR）等，并通过肝脏损伤相关血清指标辅助诊断，但存在诊断效能低、诊断操作用时长等不足。环介导等温扩增技术（LAMP），指在等温（60～65℃）下，短时间内完成核酸扩增，具有操作简便、诊断用时短、诊断精确度高等优势[2]。且随该方法研究不断深入，应用LAMP 技术中，通过应用微流控芯片技术、CRISPR-Cas 技术等，可实现LAMP 技术优化，进一步提升LAMP 技术诊断效能。

1 LAMP技术原理

LAMP 为一种全新的核酸扩增方法，通过设计引物、反应（合成模板、循环扩增、延伸、再循环）获得不同茎长度茎环结构的DNA，及许多环结构的DNA 混合物。

1.1 设计引物 由4 条特异性引物识别靶基因序列两侧各3 段6 个不同核酸位点序列，应用一种具有链置换特性的DNA 聚合酶-Bst DNA 聚合酶，在等温条件下进行靶序列扩增。4 条引物分别为FIP（包含与目的片段F2c 互补的F2，与F1 片段互补的F1c）、BIP（包含与目的片段B2c 互补的B2，与B1 片段互补的B1c）、F3、B3，其中后两者为前两者外侧引物，与目的片段上F3c、B3c 互补。

1.2 扩增过程

1.2.1 合成模板 模板合成过程中，温度维持在65℃左右，引物在双链DNA 互补部位碱基配对中，会干扰双链聚合过程，解离形成DNA 单链。链置换型DNA 聚合酶作用在引物FIP 的F2 区段末端位置为起点，与模板DNA 互补配对成双链，同时引物中F3、F2c 前端与F3c 序列互补，链置换型DNA 聚合酶在末端位置作用，从头端开始置换由FIP 引物合成的DNA 链，并把靶序列合完成DNA 双链合成过程。FIP 合成的互补链中，F1 区、F1c 区，其碱基自我配对会形成DNA 单链环状结构，内部引物BIP 与该链另一端杂交，外引物B3 结合到该链上，形成新的互补链，置换出BIP 合成互补链，而被置换出来的单链两端碱基互补，自形成中间单链结构、两端环状结构的单链结构。该链经自身引导延伸作用形成双链茎环结构（哑铃状），用于LAMP 技术循环扩增模板。

1.2.2 循环扩增 引物FIP 与循环起始茎环结构结合后，DNA 双链中其中一条为延伸模板，另一条被释放出来，其3 端自身成环，在链延伸取代作用下，将上一步FIP 引导合成的链结构释放出来，作为循环起始物，引物BIP、FIP 与其上茎环结合后，重复上述延伸过程，产物延长过程中，释放新链作为下以循环起始物，最终获得长度不同的茎环状双链DNA产物。LAMP 循环扩增过程中，扩增、监测在指数增长期完成。

2 LAPM技术特点

LAMP 主要优势为灵敏度、特异度高，检出速度快、操作简便、产物检测方便。LAMP 循环扩增过程中，扩增、监测在指数增长期完成，可避免平台期扩增监测影响诊断灵敏度。而在检测中，靶基因6 个区域均被引物识别后进行扩增反应，因此诊断特异度高，若存在1 个核酸差异，LAMP 技术可通过区分相应靶序列扩增。而在LAMP 反应过程中，添加2 条环状引物，可缩短反应时间，且环状引物、茎环结构在F1 区域，或B2、B2 之间结合，从F1～F2 方向，或B1～B2 方向结合，茎环DNA 与内引物杂交，或与环状引物杂交，以启动链置换DNA 合成过程，加快反应速度，可在30～60 min 内完成检测，可将产物扩增至109～1010 倍，应用PCR 技术获得该结构，因此检出速度快、检测效率高。与其他扩增方法相比，LAMP 技术不需要复杂昂贵仪器设备，可在恒温器中完成全部反应过程，适用于基层医院推广使用，成本较低。在大量合成核酸过程中，dNTP 中所析出的焦磷酸根离子与Mg 离子结合后，其形成产物出现肉眼可见沉淀，或在400 nm 光下利用浊度检验可完成结果检出，产物检测方便。

3 LAPM技术用于肝炎病毒检测中的应用价值

3.1 肝炎病毒检测现状 甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒均为常见感染病毒，发生感染后会造成肝脏细胞损伤，随炎性反应进展可能会引发肝组织癌变，威胁患者生命安全。尽早检出肝炎病毒、尽早进行抗病毒治疗对患者尤为关键。

目前在对肝炎病毒临床诊断中，抗原-抗体特异性诊断，具有操作简单、诊断费用低、诊断用时短等优势[3]。但在患者感染早期，未发生抗原-抗体特异性反应，或患者既往感染史，会存在一定漏诊率，且此种方法对肝炎病毒感染定量效果有限[4]。PCR 技术为分子生物学诊断方法，通过检测肝炎病毒DNA 片段进行该病诊断，具有诊断灵敏度高的优势，并可同步满足肝炎病毒感染定量及定性检验。但PCR 技术操作难度大、诊断用时长且诊断费用高，在对肝炎病毒感染诊断中无法普及[5]。

血清肝功能指标，为肝脏损伤重要诊断评估方法，常见诊断指标包括谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL）等，其血清指标水平上升提示患者出现肝脏损伤[6]。应用肝功能指标诊断中，主要作为是否出现肝脏损伤及肝脏损伤程度评估，但无法将指标作为肝炎病毒直接诊断指标，可将其作为辅助诊断指标。

3.2 LAPM 技术用于肝炎病毒检测中的应用情况 LAMP 技术对肝炎病毒诊断中，对样本量要求较低，诊断灵敏度高。李雪梅[7]在对甲型肝炎病毒检测中，建立甲型肝炎病毒实时逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）快速检测方法，即选择甲型肝炎病毒外壳编码外壳蛋白VP1 的基因为特异靶基因，依据特异基因序列6 个独立区域，在引物设计网站进行引物参数设置，获得实时RT-LAMP 反应所需的 6 条引物，反应体系中，25 μl 反应混合物中包含1 μl RNA 模板，1.4 mmol/L dMTP、20 mmol/L Tris-HCL、10 mmol/L（NH4）2SO4、10 mmol/L KCL、0.1% Triton X-100、40 pmol/L FIP 及BIP、0.8 mol/L 甜菜碱、8 mmol/L MgSO4/5 pmol/L F3 及B3、8U Bst DNA 聚合酶及逆转录酶、20 pmol/L LB；所有混合物65℃恒温反应60 min，阴性对照为双蒸水。结果检测中，其产物与反应液中二价镁离子会形成焦磷酸镁（白色沉淀），应用实施浊度仪LA-500 测定结果，绘制曲线判断检测结果，分析最佳实时RT-LAMP 反应温度及诊断特异性，结果显示，最佳检测温度为63℃，最小检测限为10 拷贝/μl，且仅对甲型肝炎病毒靶基因特异。

在对乙肝病毒临床诊断中，LAMP 技术应用频率较高。周航宇[8]在一项mate 分析中，在PubMed、Cochrane 临床试验数据库、EMBASE、CNKI 等进行文献搜索，共计纳入12 篇参考文献，利用Stata 12.0软件进行发表偏倚检测，结果显示，12 篇参考文献中共计1494 份样本，应用随机效应模型计算合并效应量，结果显示，LAMP 对乙型病毒感染诊断合并灵敏度为0.922，合并特异度为0.860，合并阴性似然比为0.093，合并阳性四完毕为15.400，诊断优势比（DOR）为311.090，综合受试者工作特征（SROC）曲线下面积为0.986，Q 指数为0.949，s 漏斗图检验结果提示无明显发表偏倚，提示在对乙型肝炎病毒诊断中，LAMP 对其综合诊断能力较高。

丙型肝炎病毒临床诊断中，多以RT-PCR 方法诊断，但其诊断特异性较低。近年来在对丙型肝炎诊断中，LAMP 技术应用频率逐渐提升。杨川琪[9]在对丙型肝炎病毒诊断中，针对丙型肝炎病毒HCV-1b、2a、3、6a 基因型设计其亚型引物，设计一对通用引物扩增HCV-1b、3a、3b，另外设计一对通用引物扩增HCV-2a、6a，并在两个体系中分别设计亚型探针，依据HCV 全基因5'UTR～Core 区中各基因型特异基因序列，软件设计对应引物后，优化LAMP 反应体系，并设计HCV-1/3、2/6 引物用于解螺旋酶恒温扩增（HDA），对每个体系设计相应基因探针进行基因分型，并与荧光定量PCR 检测结果对比，结果显示，LAMP技术对HCV-1b、3、6a 型最低检测限为1.5×103IU/ml，HCV-2b 最低检测限为1.0×103IU/ml，与PCR 法相比，两种方法阳性检出率相近，但LAMP 技术结果检出时间为60 min 左右，较PCR 技术的90 min 短。

4 LAPM技术不足及优化措施

4.1 LAPM 技术不足 LAMP 技术为多种酶复合反应体系，酶处于非最佳反应温度范围内时，酶反应能力下降，甚至会发生相反效果，如限制性内切酶活力下降，可能会出现聚合酶碱基错配延伸概率升高、发生非特异性切割等情况。而在反应过程中，若未发生温度变化，可能会影响DNA 双链结构未能完全打开，或重复序列出现发夹结构变化，或引物与互补片段错配，或在反应体系中发生引物之间非特异性互补，出现假阳性情况。若患者样本来源复杂，样本中可能存在扩增反应抑制物，影响反应灵敏度。

4.2 LAPM 技术优化措施 恒温条件可能会出现单链DNA 形成局部二级结构。甜菜碱为一种生物碱，化学结构与氨基酸相似，在反应体系中加入甜菜碱，可帮助DNA 聚合酶顺利通过DNA 二级结构，避免在聚合过程中DNA 聚合酶从模板中分离。单链结合蛋白（SSBs）与单链DNA 非特异性结合后，可避免DNA 单链形成二级结构，同时可避免DNA 单链被核酸酶降解。CRISPR 为原核生物基因组内一段重复序列，而在CRISPR-SDA 恒温扩增过程中，若缺少SSB 蛋白，则引物3'末端难以与dsDNA 结合，因此会影响扩增实验结果；而在反应过程中增加SSB 蛋白，会增加反应速率，并减少背景信号干扰，提升诊断效果。

细胞高度拥挤状态，酶促反应速率相应提升，而在反应体系中增加多聚糖、聚乙二醇，可提升聚合酶活性，将样本非折叠状态改变为折叠状态，以增强酶稳定性。

在反应过程中，需严格控制样本质量，避免样本中蛋白酶、血红素等物质影响酶结构及酶活性。血清白蛋白（BSA）中赖氨酸含量较高，其结构中疏水键可相互作用，降低酚类化合物对蛋白酶功能影响。海藻糖具有脱水、干燥、抗氧化等作用，在反应体系中添加海藻糖，可减少样本中不良因素对酶稳定性影响，即在应用海藻糖过程中，可与蛋白酶表面残余水分子结合后，提升蛋白酶构象稳定性。在此基础上，将LAMP 技术与其他方法联合应用，包括荧光定量LAMP、膜吸附法结合可视化LAMP 等，可进一步提升诊断效能。

5 小结

肝炎病毒为临床常见诊断内容，应用LAMP 技术可满足肝炎病毒诊断需求，且具有诊断速度快、诊断效能高等优势，设计不同基因型探针，可满足病毒不同基因型诊断检出结果。随近年来LAMP 技术进展及优化，可减少细胞折叠、样本杂质等因素对诊断结果影响，可进一步提升LAMP 技术诊断效能。