中性粒细胞胞外诱捕网（NET）与肝脏疾病的关系

仁增卓嘎， 杨康洁， 芦永良， 王志鑫， 王海久

1 青海大学附属医院 a.肝胆外科， b.检验科， 西宁 810001

2 拉萨市人民医院麻醉科， 拉萨 850000

中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NET）可由致病菌、免疫复合物、血小板、佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等刺激中性粒细胞产生［1］。其释放过度会导致多种免疫细胞相互作用，促使IL-8、IL-6、TNF-α等多种细胞因子分泌，从而促进炎症引发组织损伤［2］。NET不但与自身免疫疾病、癌症和血栓形成在内的几种疾病的病理生理有关，而且近些年研究表明，NET在肝脏疾病中发挥重要作用，且NET的过度释放还可加速肝脏疾病向肝癌的进展。本文通过综述NET在乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、缺血再灌注损伤、肝脏肿瘤中的最新研究进展，为相关肝病的诊疗和肝癌的预防提供新的思路。

1 NET形成机制与肝脏病理机制

1.1 NET形成机制 NET是细菌、病毒、细胞因子、LPS和PMA等物质刺激中性粒细胞产生的，其中PMA［3］能够最大限度激活中性粒细胞，形成由中性粒细胞弹性酶（neutrophil elastase，NE）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、瓜氨酸化组蛋白（H3 citrullination，H3cit）等组成的纤维网状结构［4］。此过程不同于凋亡和坏死的死亡方式，被称为“NETosis”。且根据是否导致中性粒细胞死亡分为可溶性NET和非可溶性NET两种，又称为氧化依赖性和非氧化依赖性。

可溶性NET是中性粒细胞在PMA［3］刺激下，结合PKC和RAF-MEK-MARK信号通路，使NADPH酶激活释放氧自由基（ROS），从而激活肽基精氨酸脱亚胺酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）使组蛋白上精氨酸正电消失，并转化为瓜氨酸，导致DNA和组蛋白间电荷破坏，染色质解体。解体的染色质和颗粒蛋白释放到细胞外空间形成NET，其中，ROS产生是NET形成的关键。在可溶性NET形成后，由于染色质的解体，中性粒细胞丧失吞噬和趋化作用。非可溶性NET是细菌［5］、Toll样受体2（TLR2）［6］刺激中性粒细胞，激活PAD4，使NE易位进入细胞核，细胞核中的染色质通过囊泡形式排出细胞外形成的。此过程不依赖NADPH酶，且不破坏质膜，因此，在非可溶性NET形成过程中中性粒细胞仍具有吞噬和趋化能力。

1.2 NET形成与肝脏病理机制 NET在肝脏中通过Kupffer细胞和中性粒细胞清除血源性细菌，发挥先天自身免疫的关键任务。其中，Kupffer细胞具有免疫球蛋白超家族补体受体（CRIg），可识别补体C3调理颗粒、外源性抗原及病原体，捕获及吞噬病原体［7］。另外，Kupffer细胞可通过招募血小板，使Kupffer细胞表面血管性血友病因子（vWF）与血小板糖蛋白（GPIb）相结合，导致血小板聚集，促进细菌的清除（图1）。其机制尚未清楚，可能原因是Kupffer细胞激活内皮细胞Toll样受体4（TLR4），使得中性粒细胞黏附于肝窦内皮细胞，包围感染的Kupffer细胞，从而阻止病原体通过血液传播。研究表明，黏附的中性粒细胞能与整合素介导的血小板相结合触发NET释放，通过中性粒细胞-血小板-NET轴刺激颗粒蛋白，其中组蛋白激活凝血酶［8］，使其进而形成纤维蛋白原，导致肝窦内微血管血栓的形成（图1）。凝血酶的产生不仅导致纤维蛋白原凝块的形成，还可通过蛋白酶激活受体增强血小板的活性。NE和MPO又通过蛋白酶激活受体激活血小板，释放NET。综上所述，NET在肝脏中形成过程是一种循环，即肝脏中性粒细胞-血小板-NET轴，血小板诱导NET形成，NET自身蛋白颗粒又激活血小板，此循环既有利于致病菌的清除，又加重了炎症的进展，促进凝血和组织损伤。

图1 NET形成与肝脏病理机制Figure 1 NET formation and hepatic pathology

2 NET与肝脏疾病的联系

肝脏是杀死致病菌，发挥免疫防御的重要器官。NET被报道参与一系列疾病的发生发展，如自身免疫性疾病、血液性疾病、癌症等。现有研究表明，NET也在肝脏疾病中扮演着重要的角色。

2.1 HBV感染 慢性HBV感染与肝纤维化、肝硬化及肝癌的发生密切相关。越来越多的研究表明，HBV感染与NET间存在一定联系。当机体感染HBV时，中性粒细胞功能降低，ROS的产生出现障碍，进而抑制NET形成。Hu等［9］研究表明，HBV C蛋白或HBV E蛋白通过减少ROS的产生和自噬来抑制NET释放，其中自噬机制是纤维蛋白原样蛋白2（Fgl2）与粘脂蛋白3（Mccoln3）直接结合，调节钙离子内流启动自噬，引发Fgl2-Mccoln3-自噬轴，从而触发NET的形成，加重病毒性肝炎的肝损伤［10］（图2）。另外，对HBV感染小鼠模型的研究发现，NET形成区域有大量的纤维蛋白沉积。这意味着NET与血栓可能存在关联，可能是由于Fgl2将凝血酶原转化为凝血酶，促进纤维蛋白沉积，其具体机制值得进一步研究。综上所述，在HBV感染时，NET不仅能捕获病毒，还能引起纤维蛋白的沉积和血栓的形成，也可加重病毒性肝炎的肝损伤。

图2 NET与肝脏疾病的联系Figure 2 The association of NET with liver disease

2.2 NASH NASH是最常见的肝病之一，可由肝纤维化发展为肝硬化和肝细胞癌（HCC）［11］。研究发现，NET中的标志蛋白MPO和NE在NASH的发生发展过程中发挥着重要作用。Puli等［12］通过NE基因敲除的小鼠和野生型小鼠建立NASH模型，发现野生型NASH小鼠肝组织中NE表达增加，且NASH患者血清标志物MPO-DNA水平升高，抑制MPO能显著降低肝星状细胞的激活，导致肝纤维化发展和肝细胞损伤。Xu等［13］发现丹参酮（TⅡA）能够抑制MPO和H3cit，进而抑制NET释放，同时也证明TⅡA能够改善NASH小鼠的肝脂肪变性，降低血清中肝功能障碍标志物的表达水平。其次，多种细胞因子也可作用于NET与NASH，如IL-6和TNF-α促炎因子，刺激NASH患者NET的形成，且增强NASH促凝血活性［14］。另外，Wang等［15］通过小鼠模型研究发现，NET可通过促进调节性T淋巴细胞（Treg）分化，促进NASH脂肪变性，导致肝脏肿瘤的发生和发展（图2），抑制NET可降低NASH肝脏中Treg活性及肿瘤的发生。

2.3 肝缺血再灌注损伤 缺血再灌注损伤是先天免疫性的无菌炎症反应，常发生于肝移植术后和肝切除术后。越来越多的研究发现，中性粒细胞作为肝缺血再灌注损伤的主要驱动力，缺血后释放ROS，促进NET形成，进而加重肝损伤［16］。如高迁移率族蛋白1（nuclear factor high mobility group box 1，HMGB1）通过TLR4诱导染色体解聚，形成NET发挥促炎作用［17］，而羟氯喹通过阻断TLR9抑制PAD4的表达来抑制NET形成［16］，保护肝缺血再灌注损伤。除这些化学物质外，一些炎性因子也会导致肝缺血再灌注损伤加剧，研究人员［18］通过计算机动态网络分析，发现肝缺血再灌注损伤后，IL-17A促进中性粒细胞浸润和NET形成，加重肝损伤。在富含组氨酸糖蛋白（histidine-rich glycoprotein，HRG）小鼠模型中发现，HRG小鼠存在严重肝损伤且伴有中性粒细胞和NET形成增加，通过HRG预处理后可抑制中性粒细胞和NET形成，减轻小鼠缺血再灌注损伤［19］。另外，黄姜素也可通过抑制MEK/ERK信号通路来减轻肝缺血再灌注损伤［20］。此外，研究［21］发现苯甲酸酰肼、西维来司等化学物质也可通过抑制NET的形成减轻缺血再灌注损伤（表1）。综上所述，抑制NET的释放可减轻肝缺血再灌注损伤，这为肝移植术后和肝切除术后的缺血再灌注损伤提供了治疗策略。

表1 影响肝缺血再灌注损伤的因素Table 1 Factors that influence hepatic ischemia and reperfusion injury

2.4 NET与肝癌 HCC是我国发病率和病死率较高的恶性肿瘤，超过90%的HCC发生于HBV、NASH等代谢性疾病和缺血再灌注损伤引起的肝损伤［23］。研究［24］表明，肿瘤细胞通过释放趋化因子、蛋白酶及活化的血小板触发肿瘤微环境，将中性粒细胞招募至肿瘤微环境形成肿瘤相关中性粒细胞释放NET。相反，NET释放的NE、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、组织蛋白酶G（CG）也可刺激癌细胞的增殖和迁移，进而促进肿瘤转移（图2）。随着研究深入，人们发现NET能促进HCC的生长和转移，主要表现为血管生成增加、上皮-间质转化（EMT）相关细胞迁移、细胞外基质降解和细胞捕获。研究［25］发现，NET血浆标志物在肝硬化中升高，与肝硬化和/或HCC患者的肝功能障碍程度相关。Kaltenmeier等［26］和Wang等［27］通过对肝脏恶性肿瘤患者的血清和组织进行回顾性分析证明，NET能促进HCC的生长和转移，通过阻断CXCL2可减弱中性粒细胞向肿瘤的募集和NET的形成，并抑制HCC进展，同时该研究表明NET血清标志物可作为术前判断HCC复发风险的指标。Guan等［28］研究发现NET可捕获HCC细胞，被捕获的HCC细胞通过中和Toll样受体TLR4/9-CCOX2信号传导，激发肝细胞的转移潜能，若抑制TLR4/9-CCOX2信号传导或DNaseⅠ直接破坏NET，就可减少小鼠模型HCC的转移。Yang等［29］研究发现，HCC能够刺激富含氧化线粒体DNA的NET，从而促进HCC的转移。综上所述，NET在HCC中发挥了重要作用，干预肿瘤相关中性粒细胞抑制NET形成可成为肝癌治疗的新靶标［30］。

3 小结

近年来，国内外研究表明，NET除发挥免疫防御作用外，还从多方面参与肝脏疾病的病理生理过程，其关键成分MPO、H3cit等蛋白对疾病的发生发展都起着关键作用。本文总结了NET在乙型肝炎、NASH、缺血再灌注损伤等多种疾病发生发展中的作用。虽然NET在肝脏疾病中的具体作用机制研究尚处于起步阶段，但已有的研究［31］结果表明，DNase Ⅰ或PAD4抑制剂通过抑制NET形成，可减少多种原因所致肝损伤及肝癌的发展，使用此类抑制剂可减少中性粒细胞向肿瘤的募集。但目前NET在肝脏疾病中的研究尚处于初级阶段，未来深入研究NET对肝脏疾病的影响及机制，以期为肝脏疾病治疗和预后的早期识别提供新的思路。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：仁增卓嘎负责课题设计，收集文献，撰写论文；杨康洁参与图片制作；王志鑫参与论文修改；芦永良、王海久等负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。