高敏PCR在HBV极低病毒载量的慢性乙型肝炎患者中检测的临床意义

邱功钦， 谢丹， 陈姿任， 欧阳石

广州医科大学附属第五医院 a.感染性疾病科， b.广东高校生物靶向诊治与康复重点实验室， 广州 510000

HBV感染仍然是一个严重的全球公共卫生问题。全球约有2.96亿人为慢性HBV感染，每年约有150万新发感染者，乙型肝炎每年约导致82万人死亡，其中大部分死于乙型肝炎肝硬化和肝细胞癌［1］。核苷（酸）类似物（nucleotide analogues，NAs）抗病毒治疗可抑制HBV的持续复制，从而减轻肝细胞炎症、坏死及肝纤维化程度，延缓和减少终末期肝病事件的发生，改善HBV感染者的生活质量及延长生存时间［2-4］。近年来发现，即使在长期接受NAs药物治疗的患者中，仍有部分患者血清HBV DNA处于间歇或持续性低水平检出阳性状态，即存在低病毒血症（low-level viremia，LLV）［5］。已有研究［6-12］报道LLV患者预后不良，短期有增加耐药的风险以及病毒学突破的风险，长期可能增加肝纤维化进展和肝癌发生风险，并使肝癌患者的总体生存率更低。但是之前由于PCR检测灵敏度的限制，很多应用普敏PCR检测HBV DNA＜100 IU/mL的人群被视为核酸定量阴性，随着高灵敏的实时荧光定量PCR应用，HBV DNA定量在10～99 IU/mL的这部分人群被发现。本文将HBV DNA在10～99 IU/mL的这部分定义为极低病毒载量（very low viral load，VLVL）。目前国内外尚未见VLVL的相关研究报道。本研究聚焦NAs经治≥48周、经普敏PCR检查HBV DNA（检测下限100 IU/mL）结果为阴性（低于检测下限）的慢性乙型肝炎（CHB）患者，进一步行高敏HBV DNA检测（检测下限10 IU/mL），以发现CHB患者中的VLVL人群，揭示该人群的临床特点及影响因素，为临床及时调整治疗方案提供精准实验室依据，为实现CHB精准治疗提供有意义的临床参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2019年9月—2022年2月就诊于本院感染科接受NAs治疗的CHB患者的临床资料。纳入标准：（1）符合我国《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［13］中CHB的诊断标准；（2）年龄≥18岁；（3）接受NAs疗程≥48周；（4）本院普敏PCR（检测下限为100 IU/mL）检测HBV DNA均为阴性（低于检测下限），进一步行高敏PCR法（检测下限为10 IU/mL）检测HBV DNA的患者。排除标准：（1）合并甲、丙、丁、戊型肝炎或HIV感染者；（2）合并失代偿期肝硬化、酒精性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝病、遗传代谢性肝病、肝癌等其他肝病；（3）合并其他严重脏器疾病或其他恶性肿瘤；（4）既往接受或目前正在使用干扰素、免疫抑制剂、细胞毒性药物治疗；（5）妊娠期或哺乳期妇女；（6）NAs抗病毒治疗依从性不佳者；（7）临床资料严重缺失，病史不全者。

1.2 观察指标 收集一般资料，包括年龄、性别、身体质量指数（BMI）、是否合并乙型肝炎肝硬化、NAs治疗时间；实验室指标：收集患者高敏PCR法检测HBV DNA结果及同期的血清病毒学指标，包括血清定量乙型肝炎表面抗原（qHBsAg）、HBeAg和前基因组RNA（pgRNA）；此外，收集肝肾功能、血脂、血常规、AFP指标；无创肝纤维化指标：肝硬度测定值（liver stiffness measurements，LSM）、血小板比率指数（aspartate aminotransferase to platelet ratio index，APRI）。

1.3 研究方法 根据高敏HBV DNA结果分为VLVL组（HBV DNA 10～99 IU/mL）和完全病毒学应答（complete virology response，CVR）组（HBV DNA＜10 IU/mL或未检测到）。HBV DNA＜10 IU/mL表示出现PCR扩增曲线，在线性检测下限10 IU/mL以下但无法准确定量。HBV DNA未检测到表示PCR扩增荧光曲线无抬头。普敏HBV DNA方法采用HBV核酸测定试剂盒（PCR-荧光探针法，中山大学达安基因有限公司），检测下限100 IU/mL，检测上限5×108IU/mL，灵敏度30 IU/mL。高敏HBV DNA检测方法采用HBV核酸检测试剂盒（PCR-荧光法，Cobas 6800/8800检测系统，罗氏诊断产品有限公司），检测下限10 IU/mL，检测上限1×109IU/mL，灵敏度2.4 IU/mL。HBV血清学标志物（qHBsAg、HBeAg）采用（Cobas e 601分析仪，罗氏诊断产品有限公司）；AFP采用电化学发光法（罗氏801原装试剂，罗氏E801全自动电化学发光分析仪），pgRNA检测采用HBV pgRNA检测试剂盒（中国广东广州SUPBIO生物技术有限公司），检测下限200 拷贝/mL，检测结果＜200 拷贝/mL为阴性，≥200 拷贝/mL为阳性。血常规、血生化等指标均在本院检验科完成。LSM测定采用瞬时弹性成像技术（应用Fibroscan设备）。APRI=［AST/AST的正常值上限×100］/血小板计数（×109/L）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用成组t检验；非正态分布的计量资料以M（P25～P75）表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料两组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。采用受试者工作特征曲线（ROC曲线）评价相关血清病毒学指标对高敏HBV DNA高于检测下限的预测价值。采用二元Logistic回归分析探讨未实现CVR的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分组情况 本研究共纳入106例患者，其中血清HBV DNA未检测到52例，HBV DNA＜10 IU/mL 30例，即CVR组共82例，占比77.4%。VLVL组（HBV DNA 10～99 IU/mL）24例，占比22.6%。

2.2 一般资料比较 106例患者中位年龄33.0岁，男性76例，中位BMI为21.9 kg/m2，14例诊断为乙型肝炎肝硬化，NAs治疗中位时长2.7年。其中，VLVL组患者年龄比CVR组更小（P=0.004）（表 1）。

2.3 临床特征比较 在血清生化学指标方面，VLVL组ALT水平明显高于CVR组（P=0.017）。肝纤维化指标方面，VLVL组FIB-4评分稍低于CVR组（P＜0.001）。在HBV血清学指标方面，VLVL组qHBsAg水平、HBeAg阳性率均明显高于CVR组（P值均＜0.05）；106例CHB患者中有52例行HBV pgRNA检测，VLVL组pgRNA阳性率亦明显高于CVR组（P＜0.05）（表2）。

表1 VLVL组和CVR组一般资料比较Table 1 Comparison of general characteristics between VLVL group and CVR group

表2 VLVL组和CVR组临床特征比较Table 2 Comparison of clinical characteristics between VLVL group and CVR group

2.4 qHBsAg水平预测高敏HBV DNA高于检测下限的ROC曲线 将高敏HBV DNA检测结果10～99 IU/mL作为阳性事件，＜10 IU/mL及未检测到作为阴性事件，应用ROC曲线分析qHBsAg水平预测高敏HBV DNA高于检测下限（＞10 IU/mL）的价值。qHBsAg水平预测高敏HBV DNA高于检测下限（＞10 IU/mL）的曲线下面积（AUC）为0.717（95%CI：0.615～0.818，P=0.002），当最佳cut-off值为1 214.5 IU/mL时，敏感度为95.5%，特异度为53.9%（图1）。

图1 qHBsAg水平预测高敏HBV DNA高于检测下限的ROC曲线Figure 1 ROC curve of qHBsAg titer prediction for highly sensitive HBV DNA above the lower detection limit

2.5 未实现CVR的影响因素分析 将单因素分析中具有统计学意义的指标（年龄、qHBsAg水平、HBeAg阳性）纳入Logistic回归分析，结果显示，HBeAg阳性（OR=3.654，P=0.027）和qHBsAg（OR=2.985，P=0.039）是未实现CVR的独立影响因素（表3）。

表3 二元Logistic回归分析未实现CVR的影响因素Table 3 Binary Logistic regression analysis of influencing factors of incomplete virology response

3 讨论

我国《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》［2］中明确指出：对HBsAg阳性者，包括正在接受抗病毒治疗的CHB患者，应尽可能采用高灵敏且检测线性范围大的HBV DNA检测方法（定量下限为10～20 IU/ml）。同时也指出，CHB患者应用一线NAs治疗≥48周经高敏HBV DNA检测仍可检出者，建议调整NAs治疗方案或者联合干扰素治疗。由此可见HBV DNA定量检测是否“可检出”成为决定启动抗病毒治疗及判断治疗效果的重要指标。本研究回顾性收集了106例接受NAs治疗≥48周经普敏HBV DNA定量检测结果为低于检测下限的CHB患者，进一步行高敏HBV DNA检测，结果显示有超过50%的患者没有达到真正意义的CVR，其HBV DNA定量为10～99 IU/mL，并且这部分患者炎症损伤水平（尤其ALT水平）、qHBsAg水平、pgRNA阳性率以及HBeAg阳性率均显著高于CVR（HBV DNA＞10 IU/mL）组。因此，高敏HBV DNA定量检测对于发现潜在慢性HBV感染VLVL患者具有重要意义，可作为HBV精准治疗策略的临床参考指标之一。临床医师不应忽视这部分患者，需及时行高敏HBV DNA检测。

有学者［5］提出NAs经治CHB患者发生LLV的可能机制与NAs药物作用机制的局限性以及NAs治疗时部分患者肝细胞的不活跃增殖状态相关，这部分患者通过换用或加用新的NAs药物可能难以彻底解决LLV问题，而近期的报道［14-15］均显示LLV亦有较高的炎症和纤维化进展风险。HBV感染者的ALT水平与肝脏炎症和纤维化程度密切相关［2］。已有研究［16-19］表明ALT在正常水平偏上限时，也会存在肝脏炎症和纤维化。本研究发现在普敏PCR检测中VLVL组往往会被归于“CVR”组，但经高敏PCR检测，实际患者仍然存在VLVL，而且其ALT水平显著高于CVR组，提示VLVL组因为病毒的存在而影响肝脏炎症和纤维化，提醒临床医生对于VLVL应重视。

qHBsAg水平作为临床上重要且常用的指标，不仅用于临床诊断，还可以反映HBV DNA的复制和预测疾病进展以及评估预后［20］。然而较少文献探究qHBsAg水平在NAs长期治疗CHB患者中VLVL的应用价值。本研究结果显示，VLVL组qHBsAg水平显著高于CVR组，且qHBsAg水平预测高敏HBV DNA高于检测下限（＞10 IU/mL）的AUC为0.717，当最佳cut-off值为1 214.5 IU/mL时，敏感度为95.5%，特异度为53.9%。因此该指标具有一定的参考价值，在尚未开展高敏HBV检测的地区，若普敏HBV DNA结果显示低于检测下限，则可依据qHBsAg水平判断患者是否处于VLVL状态，以协助决策下一步治疗方案。

血清HBV pgRNA是共价闭合环状DNA（covalently closedcircular DNA，cccDNA）直接转录的产物，可以反映cccDNA的活性［21-23］。cccDNA是HBV前基因组RNA复制的原始模板，只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙型肝炎患者病毒携带状态，以达到抗病毒的治疗目标［24］。尽管在本研究中，仅有52例（49%）患者行血清HBV pgRNA检测，但结果显示VLVL组pgRNA阳性率显著高于CVR组。提示VLVL状态的存在，是pgRNA无法彻底转阴的一个重要影响因素。

此外，本研究结果显示，HBeAg阳性和高qHBsAg水平是未实现CVR的独立影响因素。与Kim等［11］发现基线高HBsAg水平、HBeAg阳性均为CHB患者发生LLV的独立危险因素这一研究结论基本一致。这在疾病早期可以为临床医生的治疗方向提供参考。

值得注意的是，高敏HBV DNA检测结果报告包括“＜10 IU/mL”“未检测到”这两种结果，已有学者［5，25］强调应该对此两种结果进行更为清晰地辨析，前者表示样本中有PCR扩增曲线、痕量DNA确实存在但无法准确定量，而后者表示未检测到目的基因。本研究曾尝试对“＜10 IU/mL”“未检测到”进行独立分组，探讨这两种结果在临床特征方面有无差异，结果未见高敏HBV DNA“＜10 IU/mL”与“未检测到”两组临床特征有统计学差异。有无必要对HBV DNA“存在但低于检测下限”和“未检测到”这两种结果进行区分，需要从临床和检验两个角度辩证看待，这两组的临床转归和长期预后有待进一步更大样本量的研究。

综上所述，对于普敏已达到所谓“CVR”的CHB患者，经高敏HBV DNA检测后，仍可发现部分患者实际上仍处于VLVL状态。对其临床特点分析发现，这部分VLVL患者炎症损伤水平、qHBsAg水平、pgRNA阳性率以及HBeAg阳性率均显著高于CVR组，提示临床工作中还需推广普及高敏HBV DNA检测，及早发现VLVL人群，及时调整治疗方案。

本研究也存在一定局限性。本研究属于单中心横断面研究，一方面后续可进一步长期追踪VLVL患者调整治疗策略后的肝脏炎症状态、纤维化程度以及pgRNA、qHBsAg变化情况；另一方面可进一步开展多中心更大样本量研究，以区分高敏HBV DNA“＜10 IU/mL”与“未检测到”两种情况临床特征的差异。

伦理学声明：本研究方案于2023年3月28日经由广州医科大学附属第五医院伦理委员会审批，批号：GYWYL2023-60。

利益冲突声明：本研究不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：邱功钦负责数据收集及分析，撰写论文，修改论文；谢丹、陈姿任负责修改和校对论文；欧阳石负责研究设计，拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。