云黄连交配系统验证

崔 睿 左 婷 张凤婷 王祎婷

（云南国土资源职业学院 云南昆明 652501）

云黄连，学名云南黄连，又称云连，为毛莨科黄连属多年生草本植物[1-2]，是中药材黄连的原植物之一。黄连具有清热燥湿、祛火解毒等功效，为常用中药材，以黄连为原料的中成药品种已有100 多种。云黄连因其主要药用有效成分小檗碱含量显著高于其他黄连，为黄连属植物中最高，极为珍贵。其市场价格比其他黄连高出2～3 倍，为我国名贵中药材。

云黄连属于东喜马拉雅植物分区的特有植物，主要分布在怒江、独龙江流域的高黎贡山、碧罗雪山、担当力卡山，所在纬度为24° N—36°30′ N，海拔2 500～3 400 m[3]，是典型的低纬高山植物。云黄连为云南省道地药材，多生长于树脚枯枝落叶堆、湿润的陡坡或是布满苔藓的石缝中。

目前学者对云黄连的研究集中在其主要药用成分和栽培方面，对于交配系统研究较少[4]。其中，张霁等研究了不同海拔（2 100～2 700 m）下，野生和人工栽培云黄连的生物量、主要有效成分含量及产量，结果表明野生云黄连根茎和根生物量沿海拔梯度呈上升趋势，但无显著性差异[5]；和杏妞和乔玉文等对云黄连栽培技术进行了研究，主要包括选地整地、播种和育苗移栽、田间防病虫害、采收时期和后期加工等方面[6-7]；杨艳娟等对云黄连花部特征、花粉活力和柱头可授性及繁育系统进行研究，结果表明云黄连花序为多歧聚伞型，花两性，外有紫红色苞片，萼片为黄绿色，花粉活力和柱头可授性均随着时间的变化先上升后下降[8-9]。基于此，本文对云黄连的交配系统展开验证。

1 试验地概况

试验于2022 年1 月在云南省怒江州贡山县云黄连基地进行。该地地处海拔2 650 m，植被为常绿阔叶林，全年日照，年平均降水量在2 000 mm 以上，年平均气温17 ℃，为显著低纬高山气候环境。

2 试验方法

2.1 杂交指数估算

研究采用Dafni[10]的标准，在试验地随机选取云黄连小花20 朵，对其小花直径和开花状态进行测量。判断标准如下：（1）当小花直径小于1.0 mm时，记为0，1.0～2.0 mm 记为1，2.1～6.0 mm 记为2，大于6.0 mm 记为3；（2）柱头具有可授性与花药开裂散粉是否同时，同步成熟或柱头具有可授性时花药未开裂记为0，花药先开裂散粉记为1；（3）雌蕊与雄蕊的空间位置，同一高度记为0，高度不同时记为1。杂交指数（OCI）值为上述3 项结果之和。当OCI=0 时，繁育系统属于闭花受精型；当OCI=1 时，属于专性自交型；当OCI=2 时，属于兼性自交型，存在异交能力；当OCI=3 时，属于兼性异交型，自交亲和，可能需要传粉者；当OCI≥4 时，属于异交型，存在无融合生殖，但需要传粉者。

2.2 花粉-胚珠比估算

选取花药未开裂的盛花期花朵，随机选取雌蕊长花型和雄蕊长花型2 种花型的花朵各10 朵，用FAA固定液固定，分别做好标记带回实验室。将固定液中的小花依次取出，将花药用1.0 mol/L HCl 软化花粉壁，解剖花药后将花粉分别移入1.5 mL 的离心管中，用蒸馏水定容。在60 ℃水浴锅中水解15 min，充分震荡后摇匀，移取2 μL 花粉液于凹面载玻片上，在显微镜下观察并统计花粉数，重复4 次，计算单花花粉粒数。而后将雌蕊置于载玻片上，用解剖针小心挑破子房壁，观察并统计单花胚珠数。小花花粉粒数与胚珠数之比即为花粉-胚珠比（P/O）。按照Cruden[11]的方法对P/O进行判断，P/O为2.7～5.4，繁育系统为闭花受精；P/O为18.1～39.0，繁育系统为专性自交；P/O为 31.9～396.0，繁育系统为兼性自交；P/O为244.7～2 588.0，繁育系统为兼性异交；P/O为2 108.0～195 525.0，繁育系统为专性异交。P/O值的降低意味着近交程度的升高，P/O值的升高意味着远交程度的上升。

2.3 人工套袋传粉试验

按照Dafni 描述的方法开展传粉试验：（1）判断自然条件下的传粉情况。对照组（CK）不作任何处理，使其保持自然状态。（2）判断其是否需要传粉者。自发的自花传粉，开花前套硫酸纸袋，不另作其他处理。（3）判断自交是否亲和。同株异花传粉，开花前去除雄蕊，在同株异花间进行人工传粉，而后套硫酸纸袋。（4）判断杂交是否亲和。人工异株异花传粉，开花前去除雄蕊后采用其他植株的花粉进行传粉，而后套硫酸纸袋。（5）检测孤雌生殖情况。去除雄蕊后套硫酸纸袋，不另作其他处理。（6）判断结子情况是否受传粉者影响。风媒的异花传粉，去除雄蕊后套网袋（能通风通花粉），隔离昆虫。（7）检测异花花粉对结子的影响。自然条件下异花传粉行为，去除雄蕊后不另作其他处理，使其自由传粉。在花药散粉之前进行去雄工作，人工授粉时将其他花朵取下，然后直接将其花药对准待授粉花朵的柱头，使其充分授粉。在果实完全成熟后，采集种子，然后进行结实率的统计。

3 结果与分析

3.1 杂交指数估算

测量结果显示，云黄连小花朵直径为 8.9～18.1 mm，依据Dafni 的标准，其花朵直径大于6 mm，记数为3；部分云黄连小花雌蕊先成熟，部分雄蕊先成熟，故记为0 或1；雌蕊与雄蕊在空间上分离，记为1。云黄连的OCI 值为4 或5，根据Dafni 的标准，OCI 值与自交率呈反比，OCI 值越大，其异交程度越高，由此判断云黄连的繁育系统属于异交型，存在无融合生殖，但需要传粉者。

3.2 花粉-胚珠比估算

由试验得出，云黄连中雄蕊长的单花花粉粒数为708 750～1 086 250 粒，平均925 745 粒；单花胚珠数为76～103 枚，平均91 枚；花粉-胚珠比为10 173。雌蕊长的单花花粉粒数为736 250～967 500 粒，平均844 167 粒；单花胚珠数为78～124 枚，平均97 枚；花粉-胚珠比为8 702，结果如表1 所示。根据Cruden的标准，可以得出结论：2 种花型的云黄连的繁育系统都是专性异交。此外，统计学分析表明，雄蕊长花型云黄连的花粉-胚珠比极显著大于雌蕊长花型（P＜0.01），说明雄蕊长花型远交程度更高。

表1 云黄连花粉-胚珠比

3.3 套袋传粉试验验证云黄连交配系统

采用人工授粉及套袋试验验证云黄连的交配系统，结果如表2 所示。自然条件下云黄连的结实率为89.47%，去除雄蕊套硫酸纸袋的结实率为48.94%，说明云黄连存在孤雌生殖情况，且孤雌生殖比例较高。不去除雄蕊套硫酸纸袋处理，隔绝虫媒与风媒的自发自花传粉结实率为59.26%，稍高于孤雌生殖的结实率，而同株异花人工传粉结实率却高达83.33%，表明云黄连自交亲和，但需要传粉者，几乎不存在自发的自花传粉。在自然界中，昆虫在同一植株上的访问存在连续性，因此同株异花传粉所引起的自交也有可能出现。人工异株异花传粉结实率为86.49%，这说明云黄连为异花授粉植物。去除雄蕊套网袋处理的结实率为47.17%，与去除雄蕊套硫酸纸袋产生的48.94%无融合生殖比例相近，去除雄蕊不套袋处理结实率高达88.89%，印证了云黄连不存在风媒传粉，依靠昆虫来进行传粉才能确保其较高的结实率。传粉实验进一步证实云黄连交配系统为异交型，自交亲和，需要传粉者，其传粉媒介为虫媒。

表2 云黄连不同传粉处理的结实率

4 讨论

高山区域由于其恶劣的环境条件，被认为是陆地生态系统中最为极端的生境之一[12-13]。长期以来，高山被认为是研究生物适应进化机制最理想的场所之一。植物繁育系统的研究是研究进化生物学中的重要部分[14]。

随着海拔的升高，传粉昆虫的种类、数量和活动能力明显下降[15]。传粉限制是高山异交植物所面临的普遍问题，且随着海拔升高限制越严重。经杂交指数估算、花粉-胚珠比估算和人工套袋传粉试验验证可知，云黄连交配系统为异交型，自交亲和，需要虫媒传粉，具有较高的孤雌生殖能力。

5 结语

云黄连由于生长环境日益恶劣等原因，野生资源日益减少，因此开展云黄连交配系统研究，了解其繁殖特性和遗传多样性，能够为保护野生资源和促进人工栽培及引种驯化提供科学依据，还可以为中药材产业的发展和野生资源的保护提供有力支持。