天然彩色蚕茧中木脂素含量测定与分析

任晓晓 杨万军 卿 卓 叶占峰 罗朝斌

（贵州省农业科学院蚕业研究所 贵州贵阳 550006）

植物次生代谢产物具有多种药理活性和重要的生物功能[1]，其中木脂素类化学成分被证明具有保护肝脏、保护神经、抗病毒、抗炎症和抗氧化等良好的生物活性[2-4]。前人研究证明，桑叶含有木脂素类化合物，可以作为提取天然木脂素的原料，但由于直接从桑树中提取活性物质比较容易受到季节、气候和地理因素的影响，且直接从植物中提取次生代谢物质其产量有限，不能满足需求[5]。因此，需要寻找其他适宜植物次生代谢产物生产的途径。家蚕以桑叶为食，食桑后桑叶中的次生代谢物质会在家蚕体内富集及转化，因此可以探索以家蚕作为生物反应器，用于生产植物次生代谢物质。为探明家蚕蚕茧中木脂素类化合物成分及含量，本研究采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS/MS）对7 个家蚕品种的5 种不同颜色的蚕茧进行分析，以期为开拓天然木脂素类化合物生产途径提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用家蚕共有7 个品种，分别为白色茧品种2 个（编号为HY、FR）、黄色茧品种2 个（编号为202、RCA）、粉色茧品种1 个（编号为CD）、红色茧品种1 个（编号为CH）、绿色茧品种1 个（编号为CL）。供试家蚕饲养于贵州省农业科学院蚕业研究所遵义基地，不同茧色品种在同室同条件下使用良桑饲喂，饲养至上蔟结茧第7 d。每个品种采集蚕茧个体混合样5 g 备用，每个品种设置3 个生物学重复。

1.2 样品进样前处理

样品经过真空冷冻干燥后使用研磨仪研磨至粉末状备用。准确称取100 mg 样品粉末，使用1.0 mL 体积分数为70%的甲醇溶液充分溶解。将溶解后的样品存放于4 ℃冰箱过夜，期间涡旋3 次以提高提取率。过夜后的样品在12 000 r/min 的条件下离心10 min，吸取上清液，使用微孔滤膜（孔径为0.22 μm）过滤，保存于进样瓶中备用。

1.3 UPLC-MS/MS 分析

使用超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC）和串联质谱（Tandem Mass Spectrometry, MS/MS）对待测样品进行检测。超高效液相色谱条件：色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm。在流动相中，水相为超纯水，有机相为乙腈。洗脱梯度为0 min，V（水）∶V（乙腈）=95∶5；11.0 min，V（水）∶V（乙腈）=5∶95；12.0 min，V（水）∶V（乙腈）=5∶95；12.1 min，V（水）∶V（乙腈）=95∶5；15.0 min，V（水）∶V（乙腈）=95∶5。流速为0.4 mL/min。柱温为40 ℃。进样量为5 μL。质谱条件：电喷雾离子源温度550 ℃，质谱电压5 500 V，帘气25 psi。

基于迈维代谢公司的自建数据库及代谢物信息公共数据库，对质谱检测的一级谱和二级谱进行定性分析。采用三重四级杆质谱的多反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring, MRM）对代谢物进行定量分析。

1.4 样本质控分析

将不同颜色蚕茧等量混合制成质控样本，在仪器分析的过程中，每10 个检测分析样本中插入一个质控样本，以检测分析过程的重复性。

2 结果与分析

2.1 木脂素类化合物鉴定

经鉴定，7 个供试品种中均检测到10 种木脂素类化合物，分别为松脂醇（C20H22O6）、杜仲树脂酚（C21H24O7）、鹅掌楸树脂醇A（C22H26O8）、松脂醇单葡萄糖苷（C26H32O11）、牛蒡子苷（C27H34O11）、5'-甲氧基罗汉松脂苷（C27H34O12）、丁香树脂酚-己糖（C28H36O13）、松脂醇二葡萄糖苷（C32H42O16）、橄榄脂素二葡萄糖苷（C32H44O17）、中脂素二葡萄糖苷（C33H44O17）。木脂素类化合物种类在不同茧色、不同蚕品种之间并无差别，推测其原因在于家蚕合成木脂素类化合物的原料源于桑叶。本试验中供试家蚕饲喂的桑叶一致，木脂素类化合物的合成代谢途径与蚕茧茧色和蚕品种无密切关系。

2.2 不同茧色蚕茧间木脂素类化合物含量分析

对7 个供试品种蚕茧样本鉴定出的木脂素类化合物进行定量分析，结果显示，不同茧色的蚕茧中10 种木脂素类化合物的含量差别较大。如表1 所示，在黄色茧中，含量最高的是松脂醇单葡萄糖苷，丁香树脂酚-己糖含量次之；在红色茧中，松脂醇含量最高，达到30 mg/g，然后依次是松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷和丁香树脂酚-己糖；在绿色茧中，松脂醇含量最高，为29.40 mg/g，其余9 种化合物的含量均较低；在白色茧中，含量最高的是丁香树脂酚-己糖，其次是松脂醇单葡萄糖苷；在粉色茧中，除松脂醇外，其余9 种木脂素类化合物的含量均较低。杜仲树脂酚、牛蒡子苷、橄榄脂素二葡萄糖苷和中脂素二葡萄糖苷在不同茧色的蚕茧中含量均较低。

表1 不同天然彩色茧的木脂素类化合物含量 单位：mg/g

2.3 同茧色不同品种间木脂素类化合物含量分析

由表1 可知，在黄色茧品种中，RCA 含有的松脂醇二葡萄糖苷的含量约为202 的3.45 倍，其余9种化合物的含量在两者之间差别较小。在白色茧品种中，HY 和FR 中含量较高的化合物种类一致，但HY 中松脂醇单葡萄糖苷、5'-甲氧基罗汉松脂苷和丁香树脂酚-己糖的含量分别是FR 中的3.20、2.66和1.96 倍。

2.4 同一品种内木脂素类化合物含量分析

对黄色茧和白色茧同品种不同样本之间的木脂素类化合物含量进行比较分析，结果如表2 和表3 所示。由结果可以看出，在同品种不同样本之间，多种化合物的含量差别较大。例如，在RCA品种中，样本1 杜仲树脂酚的含量是样本2 和样本3 的2～3 倍；在FR 品种中，样本2 松脂醇单葡萄糖苷的含量约是样本1的1.96倍。蚕茧中的木脂素类化合物来源于家蚕食用桑叶后对其中的物质加工后合成，同一品种不同的样本中木脂素类化合物含量有差异，说明家蚕个体对桑叶的吸收利用及合成木脂素类化合物的能力有差别。

表2 黄色茧的木脂素类化合物含量 单位：mg/g

表3 白色茧的木脂素类化合物含量 单位：mg/g

3 结论与讨论

本试验通过超高效液相色谱-质谱联用技术对白色茧、黄色茧、粉红茧、红色茧、绿色茧含有的木脂素类化合物进行了定性和定量检测，结果显示在本批次蚕茧中，共检测出10 种木脂素类化合物。同时发现，不同茧色蚕茧含有的木脂素类化合物种类并没有差别，但每种化合物的含量不同：黄色茧的松脂醇单葡萄糖苷和丁香树脂酚-己糖含量较高；红色茧和绿色茧的松脂醇含量较高；白色茧的丁香树脂酚-己糖含量较高；粉色茧的10 种木脂素类化合物的含量均较低。同茧色不同品种间，含量最高的木脂素类化合物种类一致，但部分种类化合物含量有明显差异。此外，同一家蚕品种所产蚕茧各样本间的木脂素类化合物含量差别也较大。

分析认为，家蚕食下桑叶后，桑叶中的次生代谢物质在家蚕体内的积累和转化是一个非常复杂的过程，除与品种特性有关外，还与个体消化、吸收、合成及累积能力密切相关[6]。此外，食桑量、环境温湿度等因素对于桑叶次生代谢物质在蚕体内的转化也有重要影响。木脂素类化合物在家蚕体内的合成和富集途径还未明确，这将是本课题下一步的研究内容。