块菌多糖的提取、结构、功能及应用研究进展

李 盼 曾祥权 李倩倩 李 健

块菌(Tuber)为盘菌目块菌科块菌属的一类生长于地下的真菌,属于子囊菌(Ascomycota),是两大类松露(Truffle)之一。松露可分为块菌和沙漠松露两大类,而块菌通常被认为是盘菌目中“真正的”松露[1],在澳大利亚、新西兰、中国和许多欧洲国家(如法国、意大利、英国、西班牙和克罗地亚)均有生长[2]。块菌孢子通常定植于树木或灌木的根部,形成外生菌根。宿主植物可以通过光合作用为块菌提供碳水化合物,而真菌促进宿主植物水和矿物质的吸收,同时释放生长素类激素吲哚-3-乙酸(IAA)和乙烯,促进宿主植物的根生长[3],二者互惠共生。块菌子实体常呈直径为2～10 cm的椭圆形或不规则圆形,颜色为黄褐色、深咖色或黑褐色,外表面装饰着明显的突疣,多为圆钝型或锥型,这些突疣被深网状的沟缝细痕分隔,而内表面具有深棕色和白色静脉结构[4]。块菌的种类繁多,主要分为黑袍块菌(Tubermelanosporum)、夏块菌(Tuberaestivum)、白麓块菌(Tubermagnatum)、中国块菌(Tubersinense)、印度块菌(Tuberindicum)、攀枝花块菌(Tuberpanzhihuanense)、假凹陷块菌(Tuberpseudoexcavatum)、结核块菌(Tuberregium)、白松露(Tuberborchii)等,其中T.melanosporum、T.aestivum和T.magnatum在市场上的销售量最高。块菌中富含多种营养及生物活性成分,包括蛋白质、多糖、多酚、游离氨基酸、矿物质和不饱和脂肪酸等[1],具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗抑郁和免疫调节等生物活性[5],近年来,真菌多糖被广泛应用于食品、医药和化妆品等行业。

文章拟对块菌多糖的提取工艺、化学结构、功能活性及其在食品加工中的应用进行系统概述,以期为未来块菌多糖在食品工业中的推广应用提供依据。

1 块菌多糖的提取工艺

1.1 溶剂提取法

溶剂提取法是基于相似相溶的原理将目标化合物从混合组分中分离出来,具有经济、便捷的优点。但与此同时,溶剂提取法也存在耗时长和提取效率低的缺点。对于块菌多糖来说,常用的提取溶剂包括热水、碱、酸等。Wu等[6]分别采用热水提取法和碱提取法提取T.regium多糖,两种溶剂提取的多糖组分W-PTR和A-PTR在颜色、溶解度、单糖和分子质量上均存在显著差异,且W-PTP的总糖含量(0.788 mg/mL)约为A-PTP(0.478 mg/mL)的2倍。Zhao等[7]优化了热水提取T.sinense块菌子实体多糖的工艺条件,其最佳条件为提取温度94.75 ℃、料液比1∶16.41 (g/mL)、提取时间2.67 h,此条件下块菌多糖提取率为10.44%。孔庆龙等[8]发现热水浸提法提取T.indicum多糖的最佳工艺条件为提取温度94.68 ℃、提取时间3.71 h、料液比1∶58.66 (g/mL),此时块菌多糖提取率为10.8%。岳金玫等[9]发现热水浸提法提取攀枝花块菌多糖的最佳工艺条件为提取温度90 ℃、提取时间60 min、料液比1∶33 (g/mL),此时多糖提取率高达13.32%,提取物中多糖含量为71.55%。

1.2 超声辅助提取法

超声辅助提取法主要通过机械作用、热作用和空化作用破坏块菌细胞壁,使多糖组分从破裂细胞中释放出来,具有操作简便、耗时少、提取效率高、提取温度低等优点。Mudliyar等[10]研究表明,超声辅助提取T.aestivum多糖的最佳工艺条件为pH 6.5、振幅25%、液固比75∶1 (mL/g)、提取时间15 min,此条件下的提取率为(68.91±1.54)%。黄治国等[11]优化了超声波辅助提取法提取攀枝花块菌多糖的工艺条件,得到最优方案为料液比1∶30 (g/mL)、超声波处理温度40 ℃、超声波处理功率100 W、超声波处理时间60 min,其提取率可达17.86%。蒲彪等[12]研究表明,超声辅助提取攀枝花块菌多糖的最佳工艺条件为超声功率140 W、超声处理时间36 min、超声处理温度50 ℃、料液比1∶40 (g/mL),此时块菌多糖提取率为18.15%。与单纯的溶剂提取法相比,超声辅助提取法显著提升了块菌多糖的提取率。

1.3 微波辅助提取法

微波辅助提取法是利用微波产生的高频辐射,将块菌细胞组织击穿,从而使组织内部的多糖溶解出来。与此同时,块菌细胞组织吸收微波辐射转变的微波能,使组织温度迅速升高,加速细胞组织分解,从而使多糖类物质更快速地释放出来。清源[13]确定了微波提取块菌多糖的最佳工艺条件为微波功率320 W、料液比1∶40 (g/mL)、微波时间200 min,此条件下的多糖提取率高达15.54%。Guan等[14]设置微波辅助提取参数为微波功率280 W、温度70 ℃、微波辅助提取5 min提取T.aestivum和T.melanosporum多糖,进一步分离纯化后得到T.aestivum和T.melanosporum多糖组分TAP和TMP分别为12.97%和11.47%。

1.4 酶辅助提取法

酶辅助提取法是基于酶的水解作用对块菌细胞壁进行降解,使多糖组分溶于溶剂中,从而达到萃取的目的。相较于溶剂提取法,酶辅助提取法对环境更为友好,是绿色提取工艺之一。而用于食用菌多糖提取的常见消化酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等[15-17]。Bhotmange等[18]采用复合酶辅助提取法提取了T.aestivum多糖,其最佳提取条件为木瓜蛋白酶1.0%、胰蛋白酶1.0%、果胶酶2.0%、提取时间90 min、pH 6.0、提取温度50 ℃,此条件下多糖得率为46.91%。清源等[19]确定了T.indicum多糖的酶法最佳提取工艺为m中性蛋白酶∶m纤维素酶=1∶7、酶用量3.6%、酶解温度41 ℃、酶解时间48 min、料液比1∶29 (g/mL)、pH 4.8,多糖的得率和含量分别为14.5%和75.96%。岳金玫等[20]研究发现,酶辅助提取攀枝花块菌多糖的最佳工艺条件为pH 5.6、酶解时间65 min、酶解温度61 ℃、木瓜蛋白酶添加量1.6%,此时多糖提取率为14.31%,多糖含量高达74.96%。此外,岳金玫[21]还考察了4种块菌多糖提取方法(热水浸提法、酶辅助提取法、超声波辅助提取法以及超声波协同酶法)对提取率的影响,发现酶辅助提取法(14.31%)、超声波辅助提取法(18.15%)相较于传统的热水浸提法(13.32%)均能提高块菌多糖的提取率,而超声波协同酶法(20.91%)提取块菌多糖的提取率为热水提取法的1.6倍。

1.5 加压液相萃取法

加压液相萃取法是在密闭容器内,通过升高压力使溶剂快速充满萃取池以加速块菌多糖的萃取,同时提高温度以增加块菌多糖在溶剂中的溶解度。Tejedor-Calvo等[22]研究表明,加压液相萃取法提取T.aestivum多糖的最佳工艺条件为溶剂中V水∶V乙醇=1∶1,提取温度180 ℃,提取时间30 min,所提取的块菌多糖含量最高为69.3%。目前,借助加压液相萃取法提取块菌多糖的相关研究较少,后续可以进一步扩大该技术的应用范围。

2 块菌多糖的化学结构

如表1所示,目前国内外对块菌多糖化学结构的研究主要围绕不同种类块菌多糖的分子质量、单糖组成及比例、单糖残基的连接方式及构型、多糖构型等方面展开,并借助气相色谱—质谱(GC-MS)连用、核磁共振(NMR)、高效液相色谱法(HPLC)、高效凝胶渗透色谱(HPGPC)、体积排阻色谱(VEC)、紫外可见光谱法(UV-Vis)和傅里叶红外光谱法(FT-IR)等技术对块菌多糖的化学结构进行表征。不同块菌来源的多糖具有不同的单糖组成、连接单元和分子质量。其中,块菌多糖的分子质量范围为5.13～2.18×104kDa,块菌的品种、生长环境、提取方法、纯化步骤等均会导致块菌多糖分子质量的差异。此外,从块菌中提取得到的多种不同的块菌多糖,其单糖组成通常由不同摩尔比的 Rha、Man、Glc和Gal组成,各单糖残基主要通过1,6-、1,4-以及1,3-等连接。不同块菌多糖的糖苷键构型主要为α构型,部分同时存在α构型和β构型,且绝大多数块菌多糖为吡喃糖。

表1 块菌多糖的化学结构†

3 块菌多糖的功能活性

如表2所示,块菌多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖和免疫调节等功能活性,与其独特的化学结构密切相关。

表2 块菌多糖的功能活性

3.1 抗氧化活性

不同分子质量块菌多糖的抗氧化活性也存在一定差异。岳金玫[21]对攀枝花产印度块菌粗多糖进行超滤,分离得到了3种不同分子质量的块菌多糖组分TIP-Ⅰ(<50 kDa)、TIP-Ⅱ(50～100 kDa)和TIP-Ⅲ(>100 kDa),3种多糖组分的抗氧化能力与其分子质量大小紧密相关,总还原能力和自由基清除能力大小顺序为TIP-Ⅲ>TIP-Ⅱ>TIP-Ⅰ,螯合铁离子能力大小顺序为TIP-Ⅰ>TIP-Ⅱ>TIP-Ⅲ。

3.2 抗肿瘤活性

近年来,块菌多糖被证明具有一定的抗癌作用,与其抑制瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞死亡的作用有关。Tao等[34]从T.regium中提取的水溶性超支化β-葡聚糖,编码为TM3b,在体内和体外均显示出有效的抗肿瘤活性,可以抑制肝癌细胞系HepG2细胞的生长。而Zhao等[35]从3个块菌子实体(T.indicum,T.himalayense,T.sinense)和4个块菌发酵体系(T.melanosporum,T.indicum,T.sinense,T.aestivum)中分离出52个多糖组分,各多糖组分对HepG2、A549、HCT-116、SK-BR-3和HL-60细胞增殖的抑制作用表现出明显的剂量依赖性。其中,从块菌发酵体系中分离出的多糖的最大细胞生长抑制率为69.95%,比从块菌子实体中分离出的高约16%,可能是块菌发酵体系分离出的多糖中β-D-葡聚糖的三螺旋构象在增强抗肿瘤活性方面发挥了重要作用。此外,通过分析其多糖组分的分子结构发现,过高的重均分子质量还可能会削弱抗肿瘤活性。

3.3 降血糖活性

多糖的降血糖活性通常与其对相关消化酶以及肝脏糖代谢过程中相关酶表达的抑制作用有关[36]。魏鑫悦等[37]测定了攀枝花块菌多糖的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的体外抑制作用,发现多糖组分对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50值分别为1.99,3.30 mg/mL。Huang等[38]从T.regium菌株发酵菌丝体中提取得到3种多糖组分1P、2P和3P,可以显著降低糖尿病小鼠空腹血糖水平和糖化血红蛋白(HbA1c)水平,恢复糖尿病大鼠的胰岛素水平,且1P降低血糖作用比2P和3P的更明显。块菌多糖的降血糖作用可能归因于其抗氧化能力,在减少胰岛B细胞损伤和恢复胰岛素水平方面起关键作用。

3.4 抗疲劳活性

块菌多糖可以通过提高机体的糖原含量、提高机体肌肉组织中相关乳酸清除酶的活性、缓解机体蛋白质、氨基酸的分解代谢以及缓解机体氧化损伤来达到一定的抗疲劳效果。马宁[39]对印度块菌多糖EPT进行了体内抗疲劳试验,发现高剂量(3 g/kg BW)EPT处理能显著提高小鼠的力竭游泳时间,使游泳小鼠的肝糖原、肌糖原含量恢复到正常水平。EPT还能显著提高小鼠组织细胞中的乳酸脱氢酶活性,加速肌肉中乳酸的清除代谢,防止肌肉中乳酸积累,降低小鼠血清中肌酸激酶活性、力竭游泳后小鼠的肌肉损伤程度、血清中尿素氮水平和机体蛋白质和氨基酸的分解代谢,从而减缓肌肉力量的降低。此外,EPT处理还可明显降低小鼠血清中羟自由基含量,血清、肌肉、肝脏中的丙二醛含量,增加小鼠血清中脂肪酸水平,说明块菌多糖能防止自由基造成的细胞结构和功能的损伤,利用脂肪酸氧化供能,从而减少肌糖原无氧酵解产生乳酸,达到一定的抗疲劳效果。李陆[40]通过印度块菌多糖灌胃小鼠的负重力竭游泳试验探究了块菌多糖的运动抗疲劳效果。研究表明,高、中、低3种剂量的块菌多糖处理组均可显著延长小鼠的平均力竭游泳时间。此外,各剂量多糖灌胃处理组小鼠的肝重系数均较对照组显著升高,且显著性随多糖剂量的增加而增大,说明块菌多糖能延长小鼠的肌肉耐受能力并提高小鼠的肝糖原储备,从而起到抗疲劳的作用。

3.5 免疫调节

块菌多糖能够通过影响免疫器官、免疫细胞、免疫分子、补体系统和细胞因子等对免疫系统进行调节。赵玲[41]对中华块菌T.sinense粗多糖CTP进行了体内外免疫活性测定,体外试验结果表明,CTP对小鼠脾淋巴细胞增殖及腹腔巨噬细胞分泌NO的促进作用随CTP浓度的增加而增加。体内试验中,CTP能显著促进免疫抑制小鼠胸腺指数的部分恢复,同时对免疫抑制小鼠脾脏指数也有一定的促恢复作用。此外,CTP还能增强免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用。其中,低剂量(50 mg/kg)CTP可以显著增加免疫抑制小鼠外周血中白细胞数量,红细胞数量与血红蛋白含量。胡慧娟等[42]对T.sinica中提取得到的多糖PST进行了小鼠免疫调节活性评价,观察到PST不仅能增加小鼠脾脏的重量,增加小鼠外周血中白细胞数量,促进T淋巴细胞转化和绵阳红细胞所引起的迟发型超敏反应,还能提高小鼠血清的抗体水平,说明PST有明显的免疫调节活性。

4 块菌多糖在食品工业中的应用

块菌多糖在食品工业中的应用主要围绕研制糕点和含片类产品展开。华思宁[43]采用蛋白酶酶解和超声波等现代工艺技术预处理黑松露,使多糖等有效成分大量析出。随后将预处理溶液于100 ℃恒温水浴锅中,在持续搅拌下加入葡萄糖酸钙和苹果酸锌溶液,最终在高压脉冲电场下处理3 h得到黑松露溶液。该溶液存在松露多糖螯合钙和螯合锌两种新型微量元素补充剂,可直接被人体吸收利用。在传统月饼馅料中加入50%的黑松露溶液制得月饼馅料后,按2∶8或3∶7的月饼面皮与馅料的比例制作月饼。与市面上已有的将黑松露直接粉碎加入馅料中制得的月饼相比,该工艺增加了馅料中黑松露多糖、松露多糖钙和多糖锌螯合物等有效成分,显著提高了月饼的营养价值,更加满足现代健康饮食的需求。

含片具有便于携带、方便食用等优点,受到许多消费者的喜爱。清源[13]以块菌为原料制备得到块菌多糖粉后,选用甘露醇粉为填充剂、乳糖为甜味剂与其混匀,随后缓慢加入70%乙醇制软料,进行制粒、干燥、整粒和压片后得到多糖含片,以色泽、风味、口感和组织状态为感官指标对配方进行优化。当块菌多糖粉用量为100 g,添加2%硬脂酸镁、20%甘露醇粉、45%乳糖以及体积分数为70%的乙醇,所得含片的甜味协调,口感最佳。鲜欣言[44]将块菌多糖提取液制成稠浸膏状后,采用湿法压片工艺制备得到了块菌多糖含片,当甘露醇、阿斯巴甜、柠檬酸、硬脂酸镁添加量分别为65.0%,2.0%,0.1%,0.7%时,含片的感官评价得分最高。块菌多糖含片的研制不仅丰富了块菌食品的形式,还在一定程度上推广了块菌多糖的保健功能价值。

5 结语

研究系统总结了块菌多糖的提取工艺、化学结构和功能活性及其在食品工业中的应用,为未来块菌多糖功能性食品的开发提供了一定的理论支撑。但目前关于块菌多糖的研究仍存在一定局限性,后续可以尝试借助其他方法继续优化块菌多糖的提取工艺,如超临界萃取法等。而对于块菌多糖的化学结构,还需进一步研究其主链骨架和螺旋构象等。此外,块菌多糖的其他潜在功能活性也有待进一步证明,如抗炎、抗菌和降胆固醇活性等。为了扩大块菌多糖的应用,可将其作为壁材递送不同生物活性成分以增强其稳定性及利用率,开发成新型乳液稳定剂提高乳液的稳定性或复合膜材料制备可食用薄膜或涂层以延长食品货架期,以及用于蛋白多糖复合物的制备实现新型脂肪代替物的开发,改善食品品质及营养价值。