ELL2基因多态性与涎腺多形性腺瘤易感性的相关性分析

杨思遥，王媛媛，刘建兵，刘志荣*

1山西白求恩医院/山西医学科学院同济山西医院/山西医科大学第三医院口腔科，山西太原 030032；2山西医科大学基础医学院，山西太原 030001

涎腺多形性腺瘤是常见的涎腺肿瘤之一，具有多向分化的特点，异质性高，部分涎腺多形性腺瘤可发生恶性转化[1-2]。涎腺多形性腺瘤发生多向分化和恶性转化的机制尚不清楚，环境因素(如电离辐射)、吸烟、饮酒和激素水平与该病的发生有关，但该病的分子遗传学变化目前尚不清楚。研究发现，涎腺多形性腺瘤相关基因常有重排和拷贝数变异，涉及转录因子多形性腺瘤基因1(pleomorphic adenoma gene 1，PLAG1)和高迁移率族AT Hook 蛋白2(highmobility group AT-hook 2，HMGA2)[3-4]。1997 年，Shilatifard 等[5]发现，转录因子家族的新成员——RNA 聚 合 酶2 延 伸 因 子(elongation factor for RNA polymerase Ⅱ 2，ELL2)基因位于5q15，有12 个外显子。ELL2 在浆细胞分泌免疫球蛋白中起核心作用，能有效地指导mRNA 的剪接加工，调节其转录活性[6-7]。ELL2可调节细胞的生长和增殖，在人类恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用[8-9]。有研究发现，ELL2是多发性骨髓瘤的易感基因且rs3888189-C等位基因与涎腺癌的发生有关[10]；ELL2 是雄激素受体(AR)阴性前列腺癌细胞生存和增殖所需的潜在致癌蛋白[11]。本研究对腮腺多形性腺瘤家系5 个成员的ELL2 基因外显子进行了扩增和测序，并招募了112例涎腺多形性腺瘤患者及176 名健康对照者检测其ELL2 基因1119T＞C 多态性，旨在阐明1119T＞C 多态性与涎腺多形性腺瘤发生的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 将2015年11月山西白求恩医院收治的1 例55 岁男性腮腺多形性腺瘤患者作为先证者，收集该患者的亲属信息。采用病例对照研究，纳入2016年1月-2020年7月在山西白求恩医院口腔颌面外科就诊的112 例涎腺多形性腺瘤患者(病例组)及2019年1月-2020年1月本院的176名健康体检者(对照组)进行验证分析。纳入标准：(1)按Seifert等[12]的方法，术后经组织病理检查确诊为涎腺多形性腺瘤；(2)临床资料完整；(3)进行门诊或电话随访；(4)签署知情同意书。排除标准：合并其他肿瘤或严重心、肺、肾功能障碍。本研究获山西白求恩医院伦理委员会审批(审批号：YXLL-2022-046)。

1.2 主要试剂及仪器 全血基因组DNA提取试剂盒购 自 美 国Omega Bio-Tek 公 司，RNA 提 取 试 剂RNAiso、2×PCR Premix Taq酶购自日本TaKaRa公司，LC-Green 饱和荧光染料购自美国Idaho Technology 公司。高分辨熔解曲线分析仪LightScannerTMInstrument 96 购自美国Idaho Technology 公司，实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司。

1.3 资料收集 收集腮腺多形性腺瘤患者及其亲属信息，绘制系谱图；收集病例组和对照组的一般资料，包括性别、年龄、吸烟情况、腺瘤病理组织分型等，其中吸烟情况通过问卷调查方式获得，参考Franco 等[13]吸烟情况以香烟总数计算，曾经吸烟定义为每天吸烟≥1 包、持续1 年以上；不吸烟被定义为从不吸烟，或者每天吸烟≥1 包、持续1 年以上，但戒烟超过6个月。

1.4 全血基因组DNA 提取及单核苷酸多态性(SNP)分型 采集家系成员Ⅱ4、Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ11、Ⅲ12，以及112例涎腺多形性腺瘤患者和176名健康对照的外周血约2 ml，采用全血基因组DNA 提取试剂盒提取全血DNA。使用Primer Premier 5 软件设计引物，用于扩增ELL2 外显子8 及测序的引物见表1。采用高分辨熔解曲线(high resolution melting，HRM)对ELL2 1119T＞C 进行分型。PCR 体系包含：基因组DNA 0.1 μg，上 下 游 引 物 各0.1 μl(10 pmol/μl)，2×PCR Premix Taq酶5 μl，高低温内标0.1 μl，LC-Green饱和荧 光 染 料1.0 μl，蒸 馏 水 加 至10 μl。扩 增 条 件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸6 s，共35 个循环；72 ℃延伸7 min；95 ℃变 性30 s，24 ℃退 火4 min。PCR 扩 增 产 物 使 用LightScanner™ Instrument 96自动进行基因分型。每个基因型随机抽取5 个样本，采用测序引物进行PCR扩增，扩增产物送生工生物(中国上海)进行测序，确定HRM基因分型结果。

1.5 实时定量RT-PCR 检测不同基因型个体ELL2表达水平 为明确1119T＞C 位点不同基因型个体是否影响ELL2 基因的表达，使用RNAiso 试剂从患者外周血中提取总RNA，取1 μg RNA反转录，采用实时定量PCR (quantitative real-time PCR)检测ELL2基因的表达水平，以GAPDH 为参照，引物序列见表1。对每个样品重复3次，并测定平均Ct值，以2-ΔΔCt表示ELL2的相对表达量。

表1 PCR引物序列
Tab.1 Primer sequences for PCR

1.6 指标分析 分析病例组与对照组年龄、性别和是否吸烟的差异，以及吸烟与涎腺多形性腺瘤发病风险的关系。根据病例组与对照组的基因型频率：(1)进行Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，并检验ELL2 1119T＞C 各基因型与涎腺多形性腺瘤的相关性及其在涎腺多形性腺瘤不同组织分型中的分布；(2)计算两组中吸烟与不吸烟者的等位基因C 和T 的基因频率，并将是否吸烟作为分层因素，分析ELL2 T1119C 等位基因与吸烟是否存在协同作用；(3)比较不同基因型个体外周血ELL2 mRNA 表达水平的差异。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验；计量资料呈正态分布时以±s 表示，组间比较采用t检验，呈非正态分布时组间比较采用Wilcoxon 秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 涎腺多形性腺瘤患者家系情况 涎腺多形性腺瘤患者的家系谱如图1 所示，55 岁患者Ⅱ7为先证者，该家族中有5 例患者。其中，Ⅱ5为黏液表皮样癌，其他患者为唾液腺良性腺瘤。家系中5 位成员(Ⅱ4、Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ11、Ⅲ12)进行了外显子8 扩增和测序。

图1 一例涎腺多形性腺瘤家系Fig.1 A pedigree of pleomorphic adenoma of the salivary gland

2.2 两组一般特征比较 病例组与对照组性别、年龄比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但病例组的吸烟比例高于对照组(P=0.013)(表2)，吸烟可增加涎腺多形性腺瘤的发病风险(OR=1.828，95%CI 1.131～2.956)。

表2 涎腺多形性腺瘤患者与对照组的一般特征比较[例(%)]Tab.2 Comparison of general characters between patients with pleomorphic adenoma of salivary gland and control group [n(%)]

2.3 ELL2 1119T＞C多态性与涎腺多形性腺瘤发生的相关性 对该家族5 个成员ELL2 外显子的测序结果显示，除第8 外显子在不同个体中具有TT、CT 和CC基因型外，其余序列一致(图2A)。1119T＞C位点可能是一个SNP位点。随后在112例患者和176名健康对照者中扩增了第8 外显子T1119C 位点，采用HRM法对该位点进行自动基因分型，每个基因型随机抽取5 个样本进行测序，结果显示HRM 法对于TT、CT 或CC 基因型分型与测序结果一致(图2B、C)。通过Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，对照组为遗传平衡群体(P＞0.05)；对照组最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)=0.36；基因型频率分析结果显示，涎腺多形性腺瘤患者中纯合子CC的比例明显高于对照组(P=0.002)；纯合子CC与涎腺多形性腺瘤发生风险增加相关(OR=3.059，95%CI 1.494～6.263，表3)。

表3 涎腺多形性腺瘤患者与对照组的ELL2 T1119C 基因型频率[例(%)]Tab.3 The genotype frequencies of ELL2 T1119C in patients with pleomorphic adenoma of salivary gland and control group[n(%)]

2.4 ELL2 1119T＞C多态性在涎腺多形性腺瘤不同病理类型中的分布 对112 例涎腺多形性腺瘤患者的病理类型进行分析，并比较T1119C等位基因及基因型在不同病理类型中的分布情况，结果显示不同病理类型间T1119C等位基因及基因型差异无统计学意义(P＞0.05，表4)。

表4 ELL2 T1119C等位基因及基因型在不同病理类型中的分布Tab.4 Distribution of ELL2 T1119C alleles and genotypes in different pathologic types

2.5 ELL2 1119C多态性与多形性腺瘤相关性强度的分层分析 分层分析结果显示，吸烟与C 等位基因协同作用可增加涎腺多形性腺瘤的发病风险(OR=2.180，95%CI 1.361～3.491，P=0.001，表5)。

表5 ELL2 T1119C 多态性与多形性腺瘤相关性强度的分层分析Tab.5 Stratification analysis of the strength of the association between ELL2 T1119C polymorphism and pleomorphic adenoma

2.6 T1119C 不同基因型个体外周血ELL2 的表达水平 实时定量RT-PCR 法检测结果显示，CC 基因型ELL2 mRNA 表达水平明显高于CT(P=0.035)或TT(P=0.003)基因型个体(图3)。

图3 不同基因型ELL2 mRNA的表达水平Fig.3 Expression levels of ELL2 mRNA in different genotypes

3 讨 论

涎腺多形性腺瘤缺乏特异性的分子标志物，其多向分化及恶性转化的机制尚不明确。本研究对一个涎腺多形性腺瘤家族的5 个成员ELL2 外显子进行测序后发现，第8外显子中存在一个新的SNP位点：1119T＞C，该位点可使ELL2 基因第373 位密码子由CCT 变为CCC(p.Pro373Pro)，为同义突变。5 例家族成员中有3 例为CC 基因型，1 例患者和1 例健康成员在该位点为CT 基因型。因此，本研究招募了112例涎腺多形性腺瘤患者和176名健康对照者，利用HRM法分析该位点多态性，并进行基因分型。结果显示，该位点的MAF 为0.36，属于SNP 位点。ELL2的1119-C等位基因与涎腺多形性腺瘤相关，吸烟与C 等位基因协同作用可增加涎腺多形性腺瘤的发病风险。HRM结果未显示该位点的不同基因型与涎腺多形性腺瘤的不同病理类型有关。

外显子中的一些同义突变也称为沉默突变。虽然，本研究ELL2中的1119T＞C为同义突变，但患者中CC 基因型的频率明显高于对照组，提示ELL2 1119 T＞C 位点不同基因型可影响ELL2 基因的表达。一般来说，外显子发生同义突变会导致选择性剪接或翻译效率的改变，从而影响基因的表达水平。Ando 等[14]报道了mabA(g609a)的沉默突变将突变附近 的 区 域 转 化 为 抑 制 素α 亚 单 位(inhibin subunit alpha，inhA)基因的一个替代启动子，导致异烟肼(isoniazide，INH)的inhA 靶基因表达上调，mabA(g609a)沉默突变是INH 耐药的一种新机制。外显子的沉默突变也可能导致外显子跳跃，Joshi 等[15]报道了一例45 岁的肌肉萎缩患者，在ANO5 中含有沉默突变Leu115Leu(c.345G＞A)；这种突变导致了选择性剪接，cDNA分析显示存在6号外显子跳跃，与肌营养不良发生相关。Ogasawara等[16]也报道了Rh血型D抗原(Rh blood group D antigen，RHD)基因发生960 G＞A同义突变，因而影响了基因的可变剪接，降低了D抗原的表达和外显子7的保留。

ELL2促进编码免疫球蛋白重链复合体(IgH)基因的多聚腺苷酸化和外显子跳跃。研究发现，低ELL2表达导致分泌型特异性免疫球蛋白重链mRNA 表达丰度降低。ELL2 蛋白通过刺激IgH 基因启动子近端poly(A)位点偏好和外显子跳跃，从而促进分泌型IgH mRNA 的转录后加工。因此，ELL2 通过增强非一致剪接位点的外显子跳跃和促进弱启动子近端poly(A)位点的使用，从而独特地影响IgH 前mRNA的加工[17]，并在某些肿瘤中促进细胞恶性转化[18]。对良性唾液腺肿瘤的蛋白质组学研究发现，IgH 与细胞凋亡、细胞增殖相关蛋白的过度表达有关[19]，分泌型免疫球蛋白重链表达谱对于阐明涎腺多形性腺瘤向恶性肿瘤转变的机制具有重要意义。大量研究发现，浆细胞分布、免疫球蛋白表达及免疫应答在涎腺多形性腺瘤的发生及恶性转化中发挥重要作用[20-21]。此外，肿瘤源性IgG的高表达与恶性肿瘤的发生发展呈正相关[22]。Swaminathan等[23]发现，ELL2的Thr298Ala错义变体可增加多发性骨髓瘤的发生风险；Wang 等[11]发现，ELL2 的缺失突变可诱导小鼠前列腺上皮内瘤变；在AR 阴性前列腺癌细胞中ELL2 可促进前列腺癌细胞增殖，是AR 阴性前列腺癌细胞生存和增殖所需的潜在致癌蛋白。本研究RT-PCR 检测发现，CC 基因型个体ELL2 mRNA 的表达水平明显高于CT 和TT 基因型个体。以上结果均表明，ELL2的沉默突变可能导致ELL2表达升高，并可能通过促进Ig 或其他相关基因的选择性剪接来改变Ig 等相关基因的表达水平，这些改变对多形性腺瘤的发生和恶性转化至关重要。

综上所述，本研究发现，ELL2 1119C 等位基因与涎腺多形性腺瘤相关，吸烟与C 等位基因协同作用可增加涎腺多形性腺瘤的发病风险，ELL2基因变异可能在涎腺多形性腺瘤的发生中起重要作用。由于涎腺多形性腺瘤患者术后瘤体样本量有限，本研究未能对ELL2 不同变异体腺瘤的ELL2 蛋白表达水平进行检测。后续需进一步通过构建ELL2不同变异体，在细胞水平及动物水平进一步研究ELL2蛋白表达水平及其对下游相关基因表达调控的影响，从而阐明ELL2 的1119T ＞C 变异引起ELL2 表达升高的机制，以及引起涎腺多形性腺瘤发生的分子机制。