白芥子穴位给药配伍对延胡索乙素药效动力学影响的研究

高 远 李 冀 韩东卫 周梦丹

(1 贵州中医药大学药学院,贵阳,550025; 2 黑龙江中医药大学,哈尔滨,150040; 3 贵州医科大学附属医院针灸科,贵阳,550001)

“冬病夏治”方源于张璐《张氏医通》中“冷哮方”,中国针灸学会制定的《“冬病夏治穴位贴敷”疗法临床应用指导意见(草案)》指出:该方以白芥子、延胡索、甘遂、细辛、生姜为基本处方,现代临床在此基础上进行加减[1]。该方以白芥子、延胡索为君药,其中白芥子作用尤其特殊。元代朱震亨曰:“痰在胁下,非白芥子不能达。”吴安业在《理瀹骈文》中强调“白芥子外敷,虽热勿揭,正是拔动病根”,可见白芥子深入、长效的独特作用。透皮试验表明,白芥子能够有效促进方中其他药物经皮渗透,起到透皮吸收促进剂的作用[2-3]。以上古代医家的经验、现代研究均提示,该方中白芥子不但有药理作用,还可能有一定的附加药物作用。而白芥子的独特作用是否会影响方中其他药物的体内转运,起到整体增效作用,需要对方中主要药物的分布情况进一步研究。

中药经皮吸收后,还需要经过体内分布、代谢、排泄的过程,且一直处于动态变化中,产生综合性治疗作用[4]。药代动力学-药效动力学(Pharmacokinetics-pharmacodynamics,PK-PD)模型是结合药物体内行为和药效作用,同时阐述剂量、时间、效应三者之间关系的体内研究方法[5-6]。本文以PK-PD数学拟合的方式,将“肺俞”穴皮下部位建立为抽象“房室模型”,描述该部位药效随着剂量变化的动态规律。通过构建虚拟的PK-PD“房室”,比较白芥子配伍前后,方中君药延胡索主要成分在穴位局部的动态变化规律,探讨其配伍的独特作用,为探索经典方剂立法的科学内涵,找寻外用复方配伍规律提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 新西兰家兔24只,14～21周龄,体质量1.5～2.0 kg,雌雄各半,购自黑龙江中医药大学实验动物中心[许可证号SYXK(黑)2021-005,经黑龙江中医药大学实验动物管理和使用委员会批准,审批号:2021042201],饲养条件为温度20～25 ℃、湿度(45±5)%、12 h光照,饲养1周后进行造模,取材前禁食24 h。

1.1.2 药物 白芥子饮片、延胡索饮片、甘遂饮片、细辛饮片、生姜饮片购自黑龙江中医药大学附属第一医院,经鉴定为地道药材,粉碎为细粉,临用前配制。

1.1.3 试剂与仪器 弗氏完全佐剂(Sigma公司,美国,货号:SLCC73365);戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich公司,美国,批号:货号:F200550);兔IgE酶联免疫吸附试验检测试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司,货号:SP10179);液相质谱联用色谱仪(沃特世科技有限公司,美国,型号:UPLC-TOD型H-Class e2695);色谱柱(沃特世科技有限公司,美国,型号:AC.UPLC HSS T3 2.1 mm×75 mm 1.8 μm);双通道微透析注射泵(CMA公司,瑞士,型号:CMA 402 Syringe Pump);4 mm微透析探针(CMA公司,瑞士,型号:CMA20Elite);双通道灌注器(CMA公司,瑞士,型号:CMA 1.0 mL);全功能酶标仪(伯腾仪器有限公司,美国,型号:Synergy H1);高速冷冻离心机(Eppendorf股份公司,德国,型号:5424R)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 以1.2 mL/kg剂量注射10%卵蛋白溶液,作为首次致敏,14 d后置于一密闭容器内,1%卵蛋白、弗氏完全佐剂生理盐水溶液雾化激发至出现腹肌抽搐、烦躁、唇鼻发绀、二便失禁等现象,连续7 d则造模完成。随机分为延胡索单方组、缺白芥子组、全方组,每组8只。

1.2.2 穴位贴敷干预方法 按处方比例取白芥子、细辛、甘遂、延胡索、麻黄、黄芩(2∶2∶1∶2∶1∶1)的药材细粉共10 g,混合均匀,姜汁调增加黏性,成2 cm×2 cm大小的穴位贴,取家兔背部“肺俞”穴位(所选穴位为《张氏医通》记载),于模型家兔背部第3胸椎棘突下旁开1.5 cm处贴敷给药。延胡索单方组给予处方剂量延胡索(0.22 g)进行穴位贴敷;全方组按照处方穴位贴敷给药;缺白芥子组按照处方排除白芥子进行穴位贴敷给药。

1.2.3 检测指标与方法 1)延胡索乙素关节腔微透析采集方法的建立:CMA20微透析探针植入模型家兔背部“肺俞”穴皮下,2 μL/min流速,持续收集30 min的透析液作为该时间点的到的样本。于给药后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14 h(14 h内透析探针具有良好的回收率)收集透析液,得到的透析液加入150 μL氯仿溶液,离心取下层溶液120 μL,蒸干氯仿后用甲醇50 μL复溶待检测。2)延胡索乙素超高效液相色谱法的建立:a.色谱条件,色谱柱ACQUITY UPLC HSS(2.1 mm×75 mm 1.8 μm);流动相甲醇-0.1%甲酸水(62∶38三乙醇胺至pH=6);体积流量0.3 mL/min;检测波长280 nm;进样体积2 μL。b.质谱条件,离子源为电喷雾离子;毛细管电压2.8 kV;去溶剂气温度350 ℃;氮气流速650 L/h;撞击能量40 eV;母离子→子离子对质荷比(m/z)356.59→191.44。c.线性范围测定,精密称取延胡索乙素对照品2.5 mg,置于25 mL容量瓶中,甲醇定容,得到对照品母液,甲醇稀释制备成100,200,400,1 000,2 000,10 000 ng/mL系列对照品溶液。d.专属性试验,制备空白透析液,微孔滤膜过滤。e.准确度与精密度试验,精密称取100、400、10 000 ng/mL对照品溶液,平行进样6次。f.加样会收率试验,精密称取延胡索乙素对照品,配制成100、400、10 000 ng/mL溶液,每个质量浓度3份,测得平均加样回收率。3)药效学样本采集及检测:2%的戊巴比妥钠麻醉模型动物,左侧颈静脉,插管后分别于给药后0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14 h(与PK-PD取样时间相对应)颈静脉处采血1 mL,每次采血后及时补充1 mL生理盐水和1 mL肝素钠。以3 000 r/min(离心半径60 cm)离心血样20 min,收集上清液,酶联免疫吸附试验法测定IgE含量。

1.3 PK-PD模型拟合及统计学方法 SPSS 20.0统计软件对实验数据进行分析,组间比较采用两两配对t检验分析,以P<0.05为差异有统计学意义。WinNonlin 5.2软件进行智能化分析,以赤池信息量准则(Akaike Information Criterion,AIC)值越小、残差平方和值越小、拟合度值越大则模型拟合越好的原则判断房室模型。以延胡索乙素浓度为药动学指标,为PK-PD数学模型提供驱动因素PK input,以IgE的抑制率为PK-PD模型提供计算药效替代指标PD endpoint,绘制“浓度-时间-效应”三维曲线图。

WinNonlin 5.2软件计算药动学参数,测定达峰时间(Tmax)、药峰浓度(Cmax)、药时曲线下面积(AUC0-t)、平均滞留时间。

得到的药代动力学参数,以时间-效应室浓度绘制到时间-PK关系;得到的药效学参数,以时间-效应绘制时间-PD关系,进行PK-PD模型拟合,获得效应室药物浓度、对应时间、药效三者(C-t-E)关系图、抑制率-药物浓度的逆时针曲线图。

2 结果

2.1 延胡索乙素测定方法建立的结果 得到回归方程Y=9 567.4X-5 422.4(R=0.999 87),在1～100 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系;色谱峰型良好,出峰位置无干扰,专属性良好;相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)分别为1.57%、1.05%、0.95%,表明仪器精密度良好;平均加样回收率为98.59%,RSD为1.22%。

2.2 药动学结果 结果最匹配的药动学模型为血管外给药的一房室模型。与缺白芥子组比较,全方组达峰时间(Tmax)更短(P<0.01),药峰浓度(Cmax)更高(P<0.01)、AUC0-t增大(P<0.01)、平均滞留时间延长(P<0.05)。见表1。与缺白芥子组比较,全方组药物在血液中出现更早,消退更缓慢。见图1。

表1 穴位给药后各组延胡索乙素的药动学参数

图1 白芥子配伍前后模型家兔体内药-时关系图

2.3 药效学结果 与延胡索单方组比较0～0.5 h无差异,1～3 h差异有统计学意义(P<0.05),4～14 h差异有统计学意义(P<0.01)。与缺白芥子组比较,全方组0～1 h差异无统计学意义,1～3 h差异有统计学意义(P<0.05),4～14 h差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。药物与效应拟合度较好,参数见表3。

表2 穴位给药后各组血清中IgE相对表达量

表3 穴位给药后各组延胡索乙素的PK-PD参数

2.4 PK-PD模型拟合结果 从浓度-时间-效应三维曲线图来看,延胡索单方组、缺白芥子组,药物浓度-效价重合度显著高于全方组;从抑制率-浓度曲线图来看,全方组的逆时针趋势显著高于延胡索单方组、缺白芥子组。见图2。

图2 白芥子配伍前后浓度-时间-效应三维曲线图、抑制率-浓度曲线图

2.5 小结 药动学结果表明,白芥子配伍可以增加延胡索乙素吸收,提高生物利用度。分析原因,可能与白芥子配伍后,改变了延胡索乙素体内吸收、分布有关。

药效学结果表明,白芥子配伍后对IgE抑制作用更明显。分析原因,可能是白芥子配伍后,改善了延胡索乙素体内过程,进而增加疗效。

PK-PD模型拟合结果表明,白芥子配伍后药物浓度与药效时间上并不是严格一一对应的。穴位处药物浓度下降期间,药效仍能够保持较高的水平甚至逐渐达到效应峰值。这一趋势表明,白芥子配伍后存在一定药效滞后现象,药物作用的效应室不实际存在,经PK-PD数学模型形成抽象的虚拟效应室。

PK-PD模型拟合结果的抑制率-浓度曲线图趋势表明,各组均属于逆时针曲线,药效滞后于药物浓度变化,从效应室到靶向部位的传递属于阶段过程。白芥子配伍后的逆时针趋势更明显,(虚拟的)效应室浓度与(局部的)关节腔浓度是完全不重合的两条逆时针曲线,结合参数Ke0值可以发现(白芥子配伍后,Ke0降低):白芥子配伍后,延胡索乙素在效应室和靶器官之间平衡速度降低,从效应室的消除速度降低,更加长时间滞留在(虚拟的)效应室、作用于穴位,更长时间刺激穴位,产生持久的药效作用,推测这是白芥子配伍后药效得到放大的原因。

3 讨论

一直以来,经典方剂立法意图、组方规律的科学内涵应该如何体现,都是中药复方现代化研究的焦点、难点问题[7-10]。“冬病夏治”方作为应用至今的外用经典方剂,必有其深刻的科学内涵需要挖掘。现代医家从药性理论、治法功效进行分析,认为该方辛温助阳、散寒止痛,适合外寒侵袭引发的哮喘[11-12]。但是仅从配伍关系、临床功效进行分析,并不全面。清代·张璐在创立此方时便认识到“该方涂后麻痹痛、切勿轻易便去”,可见此方在临床使用时需要长时间用药,使其缓缓发挥药效。本研究发现,这种长时间用药的缓慢、滞后效果与白芥子的使用有一定相关性,能帮助方中延胡索有效成分滞留穴位部位时间更长、持续发挥药效,在方剂中起到药效、改善药物穴位皮下分布的双重作用。

目前,中药复方配伍规律的研究主要从化学组成、药理学方面进行研究,近年来已经有研究者从药物动力学角度对经典方剂进行重新认识。倪建新等[13]研究左金丸的配伍规律发现,吴茱萸配伍后,黄连中主要成分小檗碱半衰期延长,达峰时间Tmax、峰浓度、AUC等药动学参数都呈现生物利用度优势。王天明等[14]研究发现,甘草和冰片配伍使用可增加甘草苷AUC0-∞、延长t1/2、缩短达峰时间Tmax。李燕等[16]发现,附子总生物碱与大黄蒽醌配伍后,附子总生物碱的指标性成分在模型大鼠体内的总入血量更大、代谢更快。米雅慧等[17]发现川芎天麻配伍后,川芎中川芎嗪、阿魏酸在大鼠脑内吸收程度增加,作用时间延长,消除速度降低,脑内蓄积量显著增加。李芸霞和彭成[18]对现有的中药附子复方研究进行整理后,认为附子在不同处方中药动学参数有明显差异,对于配伍后附子毒性研究有指导意义。

本研究在以上药动学研究基础上,结合PK-PD模型,对经典方剂配伍的科学性进行探索。PK-PD模型能够将PK和PD整合一体,完成药量和效应之间的转换,将释药体系看成一个抽象的整体,用数学方式模拟药物体内吸收-积累-起效的全过程[19-20]。而中药复方的整体性特征,恰恰可以视为一种释药体系,相当于现代药剂学概念中的给药系统[21-22]。特别对于穴位部位这种解剖学难以定位的部位,采用PK-PD数学模型拟合的建立虚拟的药动学“房室”,可以帮助我们更好地阐述药物在穴位部位分布、转运、代谢的过程。因此,以药动学研究为基础,结合PK-PD数学模型,比较配伍前后的变化,阐明穴位用药配伍的科学内涵是一种新探索,也是追溯中药复方配伍协同作用、找寻中药经典方剂遣方用药规律的新思路。

利益冲突声明:无。