大孔树脂吸附法纯化酸枣仁总黄酮的工艺研究

杜国军　洪婉婷　李占锋　刘禹萱

摘要：利用7种大孔树脂对酸枣仁的总黄酮进行纯化，依据其吸附能力及解吸能力，选出最佳的大孔树脂型号，研究了上样液浓度、上样速度、上样液体积对大孔树脂吸附率的影响以及洗脱剂类型、洗脱剂浓度、洗脱速度、洗脱剂体积对大孔树脂解吸率的影响，采用正交试验对酸枣仁总黄酮的纯化工艺进行了优化。试验结果表明，DM301大孔树脂纯化酸枣仁总黄酮效果最佳，在上样液浓度为0.1 mg/mL、上样速度为1 BV/h、上样液体积为30 mL、洗脱剂为丙酮、洗脱剂浓度为100%、洗脱速度为2 BV/h、洗脱剂体积为55 mL的条件下，获得的酸枣仁总黄酮纯度最高，相较于纯化前提高了约1.1倍。

关键词：酸枣仁；总黄酮；大孔树脂；正交试验；纯化

中图分类号：TS201.2文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2024）01-0100-07

Study on Purification Process of Total Flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen by Macroporous Resin Adsorption Method

DU Guo-jun， HONG Wan-ting， LI Zhan-feng， LIU Yu-xuan

Abstract： Seven kinds of macroporous resins are used to purify the total flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen. According to the adsorption and desorption capacity， the best macroporous resin model is selected. The effects of loading solution concentration， loading speed and loading solution volume on the adsorption rate of macroporous resins and the effects of eluent type， eluent concentration， elution speed and eluent volume on the desorption rate of macroporous resin are studied. The purification process of total flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen by macroporous resin is optimized by orthogonal test. The results show that DM301 macroporous resin has the best purification effect on the total flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen. Under the conditions of loading solution concentration of 0.1 mg/mL， loading speed of 1 BV/h， loading solution volume of 30 mL， eluent of acetone， eluent concentration of 100%， elution speed of 2 BV/h and eluent volume of 55 mL， the purity of the total flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen is the highest， which is 1.1 times higher than that before purification.

Key words： Ziziphi Spinosae Semen; total flavonoids; macroporous resin; orthogonal test; purification

酸棗仁（Ziziphi Spinosae Semen）为鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子，产于河北、陕西、辽宁、河南等地，主要成分包括黄酮类、皂苷类、生物碱类、多糖类、脂肪酸、氨基酸等[1-2]。其中黄酮类化合物具有镇静催眠、抗抑郁、抗氧化等作用，且分子量较小，易被人体消化吸收，在调味食品和保健食品中得到了一定应用[3-7]。罗晓等[8]采用超声波法提取石香薷总黄酮，结合柱层析法制备了石香薷总黄酮调味品。黄俊生[9]以白簕中的黄酮类化合物为原料，研制出颗粒完整均一、滋味醇厚的白簕特色蘸粘调味品。李玲玲[10]采用浸提法提取银杏叶总黄酮和荷叶总黄酮，以银杏叶浸提液和荷叶浸提液为原料，研发出一种色泽均匀、酸甜适中的保健饮料。

目前，国内对酸枣仁的研究主要集中于酸枣仁总皂苷及相关产品的研发，酸枣仁总黄酮的相关研究较少。常用的黄酮类化合物纯化方法包括膜分离法、硅胶柱层析法、聚酰胺树脂吸附法、大孔树脂吸附法等[11-14]。其中大孔树脂吸附法具有选择性好、易于洗脱、可重复使用、成本低的特点，且纯化后的有效物质纯度高、品质好，在天然产物分离纯化领域得到了广泛应用[15-17]。因此，本研究采用大孔树脂吸附法纯化酸枣仁总黄酮，通过单因素试验和正交试验对酸枣仁总黄酮的纯化条件进行优化，为酸枣仁总黄酮的开发利用提供了理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

酸枣仁：购于河北省赞皇县；7种大孔树脂（HPD100、NKA-9、HPD400、DM301、D101、DM130、AB-8）：郑州和成新材料科技有限公司。

1.2 试剂

芦丁标准品：上海麦克林生化科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、丙酮（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器与设备

玻璃层析柱（Φ16 mm×300 mm） 上海琪特分析仪器有限公司；SHZ-D Ⅲ循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；LXJ-2B台式低速离心机 上海安亭科学仪器厂；TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；BSA124S-CW分析电子天平 上海天平仪器厂。

1.4 试验方法

1.4.1 酸枣仁总黄酮提取液的制备

称取20 g酸枣仁粉，加入500 mL氯化胆碱-乳酸低共熔溶剂（质量比2∶1，含水量50%），在微波600 W下处理60 s，90 ℃水浴66 min，10 000 r/min条件下离心15 min，真空抽滤，获取酸枣仁总黄酮提取液。

1.4.2 大孔树脂的预处理

将大孔树脂在室温条件下用无水乙醇浸泡24 h，用蒸馏水冲洗至无醇味，用5% NaOH溶液浸泡5 h，用蒸馏水洗至中性，最后用5% HCl溶液浸泡5 h，用蒸馏水洗至中性，置于蒸馏水中备用。

1.4.3 酸枣仁总黄酮浓度的测定方法

采用NaNO2-Al（NO3）3法[18]，以芦丁为标准品，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=12.26x－0.001R2=0.999 3。测定酸枣仁总黄酮的吸光度值，代入线性回归方程即求得酸枣仁总黄酮浓度。

1.4.4 大孔树脂的筛选

1.4.4.1 大孔树脂对酸枣仁总黄酮静态吸附性能的测定

7种大孔树脂经预处理后，各称取5 g置于100 mL锥形瓶中，加入酸枣仁总黄酮提取液10 mL，密封后置于恒速振荡器中，在150 r/min条件下吸附24 h。待吸附平衡后进行真空抽滤，吸取1 mL滤液置于比色皿中，测定吸光度值，计算酸枣仁总黄酮浓度，再利用酸枣仁总黄酮浓度计算出各大孔树脂的静态吸附量和吸附率，公式如下：

式中：C0为酸枣仁总黄酮提取液中总黄酮浓度（mg/mL）；C1为吸附平衡后总黄酮浓度（mg/mL）；V0为加入的酸枣仁总黄酮提取液体积（mL）；M为大孔树脂质量（g）。

1.4.4.2 大孔树脂对酸枣仁总黄酮静态解吸性能的测定

将真空抽滤后的7种大孔树脂置于100 mL锥形瓶中，分别加入丙酮溶液10 mL，密封后置于恒速振荡器中，在150 r/min条件下解吸24 h，待解吸平衡后测定解吸液的吸光度值，计算酸枣仁总黄酮浓度，最后依据酸枣仁总黄酮浓度计算出各大孔树脂的静态解吸量和解吸率，公式如下：

式中：C0为酸枣仁总黄酮提取液中总黄酮浓度（mg/mL）；C1为吸附平衡后总黄酮浓度（mg/mL）；C2为解吸液中总黄酮浓度（mg/mL）；V0为加入的酸枣仁总黄酮提取液体积（mL）；V1为解吸液体积（mL）；M为大孔树脂质量（g）。

1.4.4.3 大孔树脂静态吸附动力学曲线及解吸动力学曲线的绘制

称取10 g大孔树脂置于锥形瓶中，加入20 mL酸枣仁总黃酮提取液，均匀混合后置于恒速振荡器中，在150 r/min条件下每隔1 h吸取上清液，测定吸光度值。将吸附后的树脂进行抽滤，用适量蒸馏水洗去树脂表面残留的总黄酮溶液后置于锥形瓶中，加入20 mL丙酮溶液，振荡解吸，每隔1 h测定解吸液的吸光度值，计算大孔树脂的吸附量和解吸量，以吸附时间（解吸时间）为横坐标，以吸附量（解吸量）为纵坐标，绘制静态吸附动力学曲线及解吸动力学曲线。

1.4.5 大孔树脂的动态吸附条件优化

1.4.5.1 单因素试验

考察上样液浓度、上样速度和上样液体积对最佳大孔树脂吸附酸枣仁总黄酮能力的影响。

1.4.5.2 正交试验

在单因素试验的基础上，以大孔树脂对酸枣仁总黄酮的吸附率为指标，设计正交试验，优化酸枣仁总黄酮的吸附工艺条件。

1.4.6 大孔树脂的动态解吸条件优化

1.4.6.1 单因素试验

考察洗脱剂类型、洗脱剂浓度、洗脱速度、洗脱剂体积对最佳大孔树脂解吸酸枣仁总黄酮能力的影响。

1.4.6.2 正交试验

在单因素试验的基础上，以大孔树脂对酸枣仁总黄酮的解吸率为指标，设计正交试验，优化酸枣仁总黄酮的解吸工艺条件。

1.5 酸枣仁总黄酮纯度的测定

将样品经减压浓缩和真空冷冻干燥处理，用无水乙醇溶解，测其浓度，计算出酸枣仁总黄酮纯度，公式如下：

纯度（%）=[（C×V）/m]×100%。

式中：C为冻干样品溶液的总黄酮浓度（mg/mL）；V为定容体积（mL）；m为冻干样品质量（mg）。

1.6 数据分析

采用Origin 2018软件绘图，采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，每组数据平行3次。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂型号的初步筛选

考察型号为HPD100、NKA-9、HPD400、DM301、D101、DM130、AB-8的7种大孔树脂静态吸附及解吸性能，结果见表1。

由表1可知，在7种大孔树脂中，DM301的吸附能力最强，吸附率达到86.33%，HPD100的吸附率次之，为84.49%；DM301和HPD100的解吸能力较强，解吸率分别达到85.44%和85.51%。综合考虑，纯化酸枣仁总黄酮的大孔树脂型号初步确定为DM301和HPD100。

2.2 最佳大孔树脂型号的确定

2.2.1 静态吸附动力学曲线

DM301和HPD100大孔树脂的静态吸附动力学曲线见图1。

由图1可知，在0～4 h内，随着吸附时间的延长，两种大孔树脂吸附总黄酮的量也在增加，在4 h时趋于平稳，说明两种大孔树脂与酸枣仁的总黄酮含量之间均属于快速吸附类型，其中DM301大孔树脂吸附酸枣仁总黄酮的量最多，为0.210 4 mg/g。

2.2.2 静态解吸动力学曲线

DM301和HPD100大孔树脂的静态解吸动力学曲线见图2。

由图2可知，在0～5 h内，两种大孔树脂解吸酸枣仁总黄酮的量随着洗脱时间的延长而逐渐增加，5 h后趋于平稳，HPD100大孔树脂与DM301大孔树脂对酸枣仁总黄酮的解吸量分别为0.176 7 mg/g和0.173 1 mg/g。

2.2.3 大孔树脂最佳型号的选择

综上所述，DM301大孔树脂对酸枣仁总黄酮的吸附与解吸能力最强，达到吸附与解吸平衡的时间最短。因此，选择DM301大孔树脂为纯化酸枣仁总黄酮的最佳树脂型号。

2.3 DM301大孔树脂纯化酸枣仁总黄酮吸附条件的确定

2.3.1 单因素试验

2.3.1.1 上样液浓度的确定

称取DM301大孔树脂20 g湿法装柱，分别加入30 mL浓度为0.025，0.05，0.1，0.15，0.2 mg/mL的酸枣仁总黄酮提取液，将流速设置为3 BV/h，收集流出液，测定吸光度值，计算吸附率，结果见图3。

由图3可知，在上样液浓度为0.1 mg/mL时，DM301大孔树脂对酸枣仁总黄酮的吸附率最高，达到63.38%。因此，选择0.1 mg/mL为最适上样液浓度。

2.3.1.2 上样速度的确定

称取DM301大孔树脂20 g湿法装柱，将30 mL浓度为0.1 mg/mL的酸枣仁总黄酮提取液上柱，上样速度分别设置为1，5 BV/h，收集流出液，测定吸光度值，计算吸附率，结果见图4。

由图4可知，当上样速度为1 BV/h时，DM301大孔树脂对酸枣仁总黄酮的吸附率最高，为64.56%。因此，选择1 BV/h为最适上样速度。

2.3.1.3 上样液体积的确定

称取DM301大孔树脂20 g湿法装柱，将适量浓度为0.1 mg/mL的酸枣仁总黄酮提取液以3 BV/h的速度上样，每5 mL收集一管流出液，测定总黄酮浓度，以流出液体积为横坐标，流出液中酸枣仁总黄酮浓度为纵坐标，绘制泄露曲线。当流出液中酸枣仁总黄酮浓度达到上样液浓度的1/10时即达到泄露点，此时流出液体积即为最佳上样液体积，结果见图5。

由图5可知，当上样液体积从5 mL增至30 mL时，上样液中酸枣仁总黄酮浓度也随之上升，在30 mL时大孔树脂吸附达到饱和。因此，选择30 mL为最适上样液体积。

2.3.2 正交试验

以DM301大孔树脂对酸枣仁总黄酮的吸附率为指标，选取上样液浓度、上样速度和上样液体积3个因素的3个水平设计正交试验表L9（33）（见表2），正交试验结果及方差分析结果分别见表3和表4。

由表3中极差R可知，在DM301大孔树脂吸附酸棗仁总黄酮过程的影响因素中，各因素的影响主次顺序为A>C>B，即上样液浓度>上样液体积>上样速度。根据3个因素的最大值KA=67.063，KB=60.983，KC=62.533，确定理论最佳吸附组合为A1B1C2，即上样液浓度为0.1 mg/mL，上样速度为1 BV/h，上样液体积为30 mL。由表4中方差分析可知，上样液浓度对吸附过程的影响显著，上样速度和上样液体积对吸附过程的影响不显著。

在正交试验所得理论适宜吸附工艺参数下进行验证性试验，DM301大孔树脂对酸枣仁总黄酮的吸附率为71.45%，高于设计表中吸附率最大值，证明正交试验成功。因此，DM301大孔树脂最佳吸附工艺条件为上样液浓度0.1 mg/mL、上样速度1 BV/h、上样液体积30 mL。

2.4 DM301大孔树脂纯化酸枣仁总黄酮解吸条件的确定

2.4.1 单因素试验

2.4.1.1 洗脱剂类型的确定

称取DM301大孔树脂20 g湿法装柱，将30 mL浓度为0.1 mg/mL的酸枣仁总黄酮提取液以3 BV/h的速度上柱，吸附完全后用3 BV的蒸馏水洗脱，再分别用55 mL的甲醇、55 mL的乙醇和55 mL的丙酮溶液以2 BV/h的速度洗脱，收集洗脱剂，测定吸光度值并计算解吸量和解吸率，结果见表5。

由表5可知，丙酮对酸枣仁总黄酮的洗脱效果最好，解吸率达到86.21%，甲醇和乙醇的洗脱效果较差，解吸率分别为66.96%和41.43%。因此，选择丙酮为最适洗脱剂。

2.4.1.2 洗脱剂浓度的确定

称取DM301大孔树脂20 g湿法装柱，将30 mL浓度为0.1 mg/mL的酸枣仁总黄酮提取液以3 BV/h的速度上柱，吸附完全后用3 BV的蒸馏水洗脱，再分别用50%、60%、70%、80%、90%、100%的丙酮溶液洗脱，收集洗脱剂，测定吸光度值，计算解吸率，结果见图6。

由图6可知，当丙酮浓度从50%增加到100%时，DM301大孔树脂对酸枣仁总黄酮的解吸率从29.46%增加到86.40%，达到了最大值。因此，选择100%为丙酮的最适浓度。

2.4.1.3 洗脱速度的确定

称取DM301大孔树脂20 g湿法装柱，取30 mL浓度为0.1 mg/mL的酸枣仁总黄酮提取液，以3 BV/h的速度上柱，吸附完全后，用3 BV的蒸馏水冲洗柱子，再用丙酮溶液分别以1，5 BV/h的速度洗脱，收集洗脱剂，测定吸光度值，计算解吸率，结果见图7。

由图7可知，当洗脱速度达到2 BV/h时，DM301大孔树脂对酸枣仁总黄酮的解吸率达到最大值75.68%。因此，选择2 BV/h为最适洗脱速度。

2.4.1.4 洗脱剂体积的确定

称取DM301大孔树脂20 g湿法装柱，将30 mL浓度为0.1 mg/mL的酸枣仁总黄酮提取液以1 BV/h的速度上柱，待吸附平衡，用3 BV蒸馏水洗脱，用恒流泵以2 BV/h的速度加入丙酮溶液，每5 mL收集一次洗脱剂，测定吸光度值，测定各管洗脱剂中酸枣仁总黄酮浓度，以收集洗脱剂体积为横坐标，洗脱剂中酸枣仁总黄酮浓度为纵坐标，绘制洗脱曲线，结果见图8。

由图8可知，随着洗脱剂体积的增加，洗脱剂中酸枣仁总黄酮浓度呈现先升高后降低的趋势。当洗脱剂体积为40 mL时，洗脱剂中酸枣仁总黄酮浓度达到最大值，当洗脱剂体积继续增加到55 mL时，洗脱剂中酸枣仁总黄酮浓度较低，趋于稳定，说明被吸附的酸枣仁总黄酮已被大部分洗脱。因此，选择55 mL为最适洗脱剂体积。

2.4.2 正交试验

以DM301大孔树脂对酸枣仁总黄酮的解吸率为指标，选取洗脱剂浓度、洗脱速度和洗脱剂体积3个因素的3个水平设计正交试验表L9（33）（见表6），试验结果及方差分析结果分别见表7和表8。

由表7中极差R可知，在DM301大孔树脂解吸酸枣仁总黄酮过程的影响因素中，各因素的影响主次顺序为F>D>E，即洗脱剂体积>洗脱剂浓度>洗脱速度。根据3个因素的最大值KD=80.617，KE=80.207，KF=81.470，理论最佳吸附组合为D3E2F3，即洗脱剂浓度为100%，洗脱速度为2 BV/h，洗脱剂体积为55 mL。由表8中方差分析可知，洗脱剂浓度和洗脱剂体积对解吸过程的影响显著，洗脱速度对解吸过程的影响不显著。

在正交试验所得理论最佳工艺参数下进行验证性试验，DM301大孔树脂对酸枣仁总黄酮的解吸率为82.83%，高于设计表中解吸率最大值，证明正交试验成功。因此，DM301大孔树脂解吸最佳工艺条件为洗脱剂浓度100%、洗脱速度2 BV/h、洗脱剂体积55 mL。

2.5 酸枣仁总黄酮纯化效果评价

DM301大孔树脂纯化前、后的酸枣仁总黄酮纯度见表9。

由表9可知，酸枣仁总黄酮经大孔树脂纯化前纯度为18.3%，经DM301大孔树脂纯化后纯度达到38.7%，纯度提高了约1.1倍。

3 结论

本试验采用7种大孔树脂对酸枣仁总黄酮进行纯化，通过考察静态吸附能力与解吸能力，确定了DM301大孔树脂为最适型号，研究了DM301大孔树脂的最适纯化条件。当上样液浓度为0.1 mg/mL、上样速度为1 BV/h、上样液体积为30 mL、洗脱剂为丙酮、洗脱剂浓度为100%、洗脫速度为2 BV/h、洗脱剂体积为55 mL时，获得的酸枣仁总黄酮纯度最高，相较于纯化前提高了约1.1倍，效果良好。

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收稿日期：2023-08-22

基金项目：黑龙江省属高等学校基本科研业务费科研项目（145109313）

作者简介：杜国军（1972－），男，辽宁铁岭人，教授，硕士，研究方向：农产品加工及贮藏工程。