Caspase家族与失神经支配骨骼肌萎缩的研究进展

田 淼， 陈 雨， 陶 朋综述， 陈 沛审校

Caspase 家族是一组结构上相似的蛋白酶，能够切割并活化蛋白质，已鉴定在人类中存在的共有11 个成员，根据主要作用分类可分为炎症Caspases和凋亡Caspases，其中，凋亡Caspases 又包括凋亡起始Caspases 与凋亡效应Caspases［1-5］。研究证明Caspase 家族各成员在神经退行性疾病中发挥作用，但研究重点为神经细胞或神经纤维［6］。对于所支配骨骼肌中Caspases 的变化情况，也有一些学者在实验中提及，虽然研究相对分散，但都提示Caspase 家族是失神经支配骨骼肌萎缩通路的重要执行因子，通过梳理Caspase 家族在其中发挥作用的主要通路有助于探索失神经支配骨骼肌萎缩的机制及治疗方向，现做如下综述。

1 凋亡Caspases

1.1 凋亡Caspases概述 凋亡Caspases根据调控细胞凋亡的激活顺序，分为凋亡起始Caspases和凋亡执行Caspases 2大类。凋亡起始Caspases分为Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10，又称为“诱导Caspases”，参与细胞外源性和内源性凋亡途径。

外源性凋亡途径中，胞外“死亡信号”通过死亡受体传递给细胞内，一些常见的死亡受体如Fas 受体、肿瘤坏死因子受体（TNFR1）等与相应死亡配体结合形成死亡域蛋白（FADD）等可激活Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10，给细胞下达“凋亡指示”，再由Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7执行凋亡事件。其通路可归纳为Fas、TNF-α 等→FADD 等→Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10→Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7的传导［7，8］。

内源性凋亡途径是由线粒体介导的，常见凋亡刺激如DNA 损伤、ATP 耗竭，可启动线粒体途径，此外还有线粒体蛋白中的Bcl-2 家族蛋白利用信号传导，使线粒体肿胀通透性增强，释放凋亡活性物质如细胞色素C（Cyt C）吸引pro-Caspase-9 等形成凋亡复合体，后进行自我剪切脱离，激活下游Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，执行细胞凋亡。其传导通路可总结为，DNA 损伤、ATP 耗竭、Bcl-2/Bax 比值变化等→线粒体膜通透性增加→释放Cyt C→活化Caspase-9→Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 激活进而执行凋亡程序［9］。

1.2 Caspases 促进失神经支配骨骼肌细胞凋亡 失神经支配后，骨骼肌缺乏神经营养支持、运动终板退化、血管床发生退变等病理变化使肌肉组织发生萎缩。Caspase 家族各成员在失神经支配肌萎缩的病理过程中也发挥促进效应。已证实Caspases参与失神经支配肌细胞凋亡［8，10，11］。肌细胞凋亡是一种由基因控制的细胞程序性死亡方式，主要表现为肌细胞缩小、细胞核固缩、染色体DNA裂解。

在失神经支配肌萎缩过程中，Caspase-3 能促进肌细胞凋亡。Borisov 等［12］观察到坐骨神经损伤后，大鼠失神经支配比目鱼肌和趾长伸肌中出现典型凋亡特征的肌细胞、同时也检测到TUNEL 染色阳性细胞，提示失神经支配后肌细胞发生了细胞凋亡。高睿琦等［13］切断大鼠坐骨神经后取腓肠肌进行检测，发现肌细胞发生凋亡的同时腓肠肌中Caspase-3 mRNA 表达增强。提示Caspase-3 在神经损伤后的肌肉组织中发挥促凋亡作用。

同时抑制Caspase-3表达能减弱失神经支配后肌细胞凋亡程度。如有研究者［14］发现，应用Caspase-3抑制剂Ac-DEVE-CHO，可显著降低失神经骨骼肌肌萎缩中细胞核凋亡的比例。董玉珍等［15］发现，神经营养素3在抑制大鼠坐骨神经损伤后腓肠肌的Caspase-3 的表达后肌细胞凋亡减弱。宗海斌等［16］在研究大鼠坐骨神经损伤实验中取腓肠肌进行检测，也发现一致现象，即抑制Caspase-3 表达能减弱肌细胞凋亡。对于Caspase-3 表达抑制后能否影响失神经支配肌萎缩其他病理改变后也有学者进行探索。如Plant 等［17］发现胫神经切断后2 周，Caspase-3 基因敲除小鼠的腓肠肌比未敲除基因小鼠的腓肠肌湿重更重，TUNEL标记的凋亡肌细胞更少。但两组泛素-蛋白酶体系总蛋白及促使萎缩的2 种特异性泛素连接酶E3［肌肉萎缩盒F（MAFbx）和肌肉环状指-1（Mu RF1）］含量均无明显区别。提示Caspase-3是通过参与细胞凋亡促使肌肉萎缩，而不影响失神经支配肌细胞中泛素-蛋白酶体系介导的蛋白质降解。虽然大多学者的研究证实Caspase-3 在失神经支配肌细胞中的促凋亡作用，但有极少学者有不同发现。Argadine 等［18］研究大鼠失神经支配膈肌发现，失神经支配1 d、3 d、5 d、7 d 后，蛋白印迹法检测膈肌中Caspase-3 活性并未增强。考虑失神经支配时间较短，Caspase-3 有增强趋势但未体现出统计学差异，或大鼠种类、实验操作等的影响。

除Caspase-3外，Caspase-8和Caspase-9也被证实在失神经支配骨骼肌中发挥相似作用。吴珍元等［19］使用Western Blot 检测坐骨神经损伤后腓肠肌中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 表达，发现均有增加且肌细胞发生凋亡。史红伟等［20］切断大鼠坐骨神经后分别于术后2 d、14 d、28 d使用分光光度法检测腓肠肌中Caspase-8、Caspase-9含量，结果提示Caspase-8、Caspase-9均有升高，且于14 d达到高峰，证明Caspase-8、Caspase-9 在神经损伤后相应靶肌肉中需一段时间达到最大效应量。张贤等［21］则发现失神经支配环杓后肌中Caspase-3 表达升高，在失神经支配3～6 月后Caspase-3 表达量逐渐达到峰值。也证明失神经支配后肌细胞中凋亡Caspases 需要一段时间达到峰值，但不同肌肉组织到达峰值时间不同，这有助于判断神经损伤后进行修复的最佳时间范围。

1.3 Caspases 参与失神经支配骨骼肌细胞凋亡的通路 失神经支配骨骼肌萎缩过程中，胞外“死亡信号”激活Caspases参与的外源性细胞凋亡途径发挥作用。能通过“死亡信号”→作用于Fas 受体等→产生FADD→激活Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10→驱动Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 进行传导。吴朝晖等［22］取臂丛神经损伤后大鼠肱二头肌，用免疫组织化学染色法检测Fas、Caspase-8，发现肱二头肌细胞发生凋亡且Fas、Caspase-8 升高。证实这一通路被激活，参与失神经支配肌萎缩的过程。

此外，失神经支配骨骼肌也发生由Bcl-2 蛋白家族参与的内源性细胞凋亡，通过Bcl-2/Bax比值变化→线粒体膜通透性增加→释放Cyt C→Caspase-3 激活进而执行凋亡程序［11］。Siu等［23］对比野生型大鼠（未敲除Bax基因大鼠）与Bax基因敲除型大鼠失神经支配腓肠肌变化情况，对两组大鼠实施胫神经断离手术，14 d 后取腓肠肌，野生型大鼠腓肠肌中Cyt C、Caspase-3、Caspase-9 均表达明显增强，Bax 基因敲除型大鼠腓肠肌中上述3 种蛋白表达均受到抑制。结合Siu［24］的另一实验，切断大鼠胫神经后14 d取腓肠肌检测发现，相比对照组，去神经支配腓肠肌的Bax/Bcl-2 比值显著增加，Cyt C 表达增强，同时Caspase-3、Caspase-9 的mRNA 上调。可提示由Bcl-2 蛋白家族介导的内源性细胞凋亡途径在失神经支配骨骼肌中被激活。另有Always 等［25］取胫神经断伤后14 d的大鼠腓肠肌及比目鱼肌，使用蛋白印迹法检测发现，失神经支配腓肠肌及比目鱼肌中Bax 蛋白水平升高、同时Caspase-8 表达增加。以上均提示失神经支配肌细胞中发生了Bcl-2/Bax 比值变化→线粒体膜通透性增加→释放Cyt C→Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10→Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7传导的肌细胞凋亡。

1.4 Caspases 参与失神经支配骨骼肌细胞凋亡的下游信号 当失神经支配骨骼肌中Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 这些凋亡执行Caspases 被激活后，迅速募集下游信号发挥凋亡效应。Caspase-3、Caspase-7 主要作用于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly-ADP ribose polymerase，PARP）［26］。PARP 负责DNA 修复与完整性监控，而Caspase-3 剪切PARP 使其失活，促使DNA 裂解而发生肌细胞凋亡。Caspase-6 能够降解稳定细胞核及细胞骨架的成分，核纤层蛋白A（lamin A）及细胞角蛋白18（keratin 18），从而导致肌细胞核及肌细胞骨架的破坏。虽然分为不同通路，但上述通路之间相互联系，且Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 能够正反馈调节凋亡起始Caspases，从而进一步促进失神经支配肌细胞萎缩。

2 炎症Caspases

2.1 炎症Caspases 概述 炎症Caspases 引起细胞焦亡包括经典细胞焦亡途径和非经典细胞焦亡途径，前者主要为Caspase-1参与；后者由 Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 介导。细胞焦亡和细胞凋亡都属于细胞程序性死亡，不同的是前者表现为细胞逐渐肿胀，胞膜破裂，是裂解性细胞死亡，会诱发炎症反应。这是因为焦亡信号激活穿孔素（GSDMD）后，在细胞膜表面形成“孔道”释放胞内炎性物质（如炎症细胞因子、趋化因子等），导致细胞的渗透性溶解及炎症反应的扩大［27-29］。炎症小体是细胞焦亡的启动物质，由核心感受器支架蛋白、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和效应器前半胱天冬氨酸酶（pro-Caspase-1）共同构成［30］。

2.2 炎症Caspases 与失神经支配骨骼肌 关于Caspase 家族主导的炎性途径在失神经支配骨骼肌萎缩的少量研究主要集中在肌萎缩侧索硬化（ALS）疾病中，在其他神经源性肌萎缩疾病中的研究报道极少，这是既往研究较少关注的肌萎缩途径，但近期研究有了新的发现。虽然临床上其他疾病如外伤所致神经损伤、周围性面瘫、脑卒中等导致肌萎缩与肌萎缩侧索硬化同属于神经源性肌萎缩，但它们的病理机制并不完全一致［31］。故肌萎缩侧索硬化中Caspases 改变能为失神经支配骨骼肌研究提供实验思路，但仍需单独研究进行验证。

Caspase-1 介导的经典细胞焦亡途径为炎症小体（NLRP3）→Caspase-1→激活IL-1β、驱动IL-18→穿孔素（GSDMD）→细胞膜形成焦亡小孔→细胞炎性死亡。Lehmann 等［32］取肌萎缩侧索硬化症状早期的患者及大鼠腓肠肌组织进行检验，发现两组萎缩肌组织中Caspase-1、IL-1β水平较对照组（健康鼠、健康人）显著升高。提示在肌萎缩侧索硬化中Caspase-1 参与失神经支配骨骼肌的萎缩过程。近期You 等［33］使用蛋白印迹法、rt-PCR 法检测证实小鼠坐骨神经断伤后14 d开始腓肠肌中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD 表达较假手术组升高，并在此后14 d 持续上升。而NLRP3 基因敲除组的小鼠在失神经支配后同期检测腓肠肌发现Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD、等炎症相关分子的表达明显减少。这证明Caspase-1 介导的经典细胞焦亡途径参与失神经支配骨骼肌萎缩过程。

3 总 结

Caspase 家族在失神经支配骨骼肌中发挥作用，其介导的细胞凋亡途径促进肌细胞萎缩已被验证。炎症Caspases 中，Caspase-1 传导的经典细胞焦亡途径也被证实参与失神经支配骨骼肌的萎缩过程，但还没有学者在实验中观察肌细胞是否存在细胞焦亡的特征形态即细胞肿胀、细胞膜破裂。故仍需进一步实验进行观察研究Caspase-1 对失神经支配肌细胞的影响。Caspase 家族中还有一部分成员的功能尚未完全厘清，暂未见相关研究记录Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 等在失神经支配肌萎缩中的变化。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：田淼负责拟定写作思路、论文撰写；陈雨、陶朋负责文献收集、论文设计；陈沛负责论文修改、指导撰写文章并最后定稿。