DNA甲基化/去甲基化调控缺血性卒中的研究进展

李亚楠， 韩非原， 王 文， 伍昊文综述， 孙宏巍审校

卒中是导致残疾和认知缺陷的主要原因，占全球所有疾病死亡率的5.2%［1］，即使是卒中幸存者，大部分也需要依赖他人才能完成行走及其他日常活动。在中国，卒中是成人致残致死的第一位病因［2］。《中国脑卒中防治报告2019》报告指出，在我国所有疾病人群中至少有1/5的死亡率来自于卒中，且卒中的发病率持续上升，特别是缺血性卒中［2］。缺血性卒中约占全部卒中的80%，具有高致残率、高复发率和高死亡率的特点，极大程度影响患者的生活质量，给个人和国家带来沉重负担。

虽然缺血性卒中的发病机制仍模糊不清，但通常认为缺血性卒中与环境因素、遗传因素及其交互作用有关，其中遗传背景相关的风险约占37.9%［3］。尽管关于缺血性卒中的全基因组关联研究发现了卒中风险相关的不同基因座，但这些遗传变异仅能解释缺血性卒中5%～10%的遗传风险［4］，这代表着很多缺血性卒中相关的遗传风险因素未被发现和重视，而表观遗传修饰就是其中之一。

1 表观遗传学与DNA甲基化/去甲基化

1.1 表观遗传学 染色质生物学是目前生物医学和转化研究中最令人兴奋的领域之一。染色质是由DNA、组蛋白和相关因子构成的一个高度复杂且紧密盘绕的生物结构。所有超越基因组学的修饰都被称为表观遗传修饰。表观遗传修饰是康拉德·沃丁顿在1942 年提出的一个术语，旨在弥合遗传学、生长和分化之间的差距，可能是基因、环境和疾病之间的重要接口［5］。理论上来说，推动表观遗传改变的常见环境因素包括但不限于日常生活方式（如吸烟、饮酒）、重金属（如铅）的接触和紫外线辐射等等。表观遗传调控可以在不改变DNA 序列的前提下进行遗传和修饰［4］，其中一些是稳定的可以遗传给后代的，另一些在环境因素的刺激下呈现出动态变化。表观遗传机制主要通过改变表观遗传密码、调控相关基因表达来操纵各种生理和病理过程。有3 种主要的表观遗传密码已经得到了很好的研究，包括DNA 甲基化、组蛋白修饰和非编码核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），其中DNA 甲基化是最重要的表观遗传机制，已被深入研究［6］。

1.2 DNA 甲基化和去甲基化 Johnson 和Coghill在1925 年首次观察到胞嘧啶残基的甲基化，1975 年Holliday 和Pugh 提出胞嘧啶残基的甲基化可以参与调控基因表达［7］。DNA 甲基化过程是在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的调控下，从S-腺苷甲硫氨酸等供体中将甲基转移到基因上的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（cytosine phosphate-guanine，CpG）中的胞嘧啶残基上，产生5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC），使染色质结构更加紧密，转录机制无法接近，导致基因表达沉默。DNMT的3个核心成员（DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b），即维持酶和从头酶［8］，在哺乳动物中均有表达。最早的DNMT1 被称为“维持甲基转移酶”，因为它可以使半甲基化的DNA 碱基对发生甲基化，而DNMT3a 和DNMT3b 属于从头甲基转移酶，可使最初非甲基化的胞嘧啶发生甲基化。

近年研究者扩展了DNA 甲基化的经典观点，认为CpG可能不是哺乳动物基因组中唯一的甲基化位点；此外DNA 主动去甲基化的证据也对这种表观遗传标记的稳定性提出了质疑。与DNA 甲基化相反，近期研究发现了DNA 去甲基化的机制，该机制通过10-11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白将5mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosin，5hmC）、5-甲酰胞嘧啶，逆转5mC变为未修饰胞嘧啶，从而去除甲基化，导致转录激活和基因表达［9］。TET主要包括3 种亚型（TET1-3），均广泛存在于大脑中［8］。除了通过TET 氧化5mC 脱甲基外，另提出了其他3种脱甲基化机制：（1）通过碱基切除修复将甲基化或氧化的碱基替换为非甲基化的胞嘧啶；（2）碱基切除修复后5mC 脱氨；（3）通过核苷酸切除修复去除5mC。

此外，DNA 甲基化还受到甲基-胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤结合域（methyl-CpG-binding domain，MBD）蛋白的调节。在MBD家族基因中，迄今为止已克隆出5个独立的基因，即编码甲基-CpG 结合蛋白2 和MBD1-4的基因［8］。MBD蛋白的重要作用之一是维持DNA 甲基化并与其直接作用，参与DNA 甲基化介导的基因表达抑制和/或异染色质形成。总之这些新进展证明了我们对DNA 甲基化呈现动态变化的更深理解。

2 DNA 甲基化/去甲基化调控缺血性卒中的研究进展

2.1 DNA 甲基化/去甲基化与卒中的发生近年来，DNA 甲基化在缺血性卒中发病机制中的作用得到重视［10，11］。各项基础研究也致力于阐明DNA甲基化与卒中发生的机制。总体来说，在缺血性卒中动物模型中，DNA甲基化的整体水平升高，并且与大脑中DNMT 的较高活性相关。Hu 等［12］发现，血栓反应蛋白1 是一种血管生成抑制因子，参与调节血小板的聚集和脑梗死的发生，在体外缺血模型中血栓反应蛋白1 基因的启动子区发生了高度甲基化。另外，血栓调节蛋白是一种表达于内皮细胞表面的膜蛋白，有抗凝血特性，对脑缺血具有保护作用。血栓调节蛋白启动子区的DNA 超甲基化与同型半胱氨酸水平升高、内皮损伤和卒中风险增加相关［13］。

临床研究发现高水平的血浆同型半胱氨酸是缺血性卒中的独立危险因素，胱硫醚β 合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）是同型半胱氨酸代谢过程的主要酶。Wang 等［14］描述了CBS 启动子区的DNA 高甲基化与人群卒中风险增加相关。CBS 启动子区的高甲基化可能导致酶活性降低、血浆同型半胱氨酸升高和卒中易感性增加。此外，血脂异常也是缺血性卒中的危险因素，载脂蛋白E 是一种参与脂质代谢的血浆脂蛋白，研究发现载脂蛋白E 基因启动子区的甲基化状态会影响脑梗死的发生风险［15］。利钠肽系统被认为是缺血性卒中的重要调节因子，研究证实4个利钠肽系统基因的DNA 甲基化下调与缺血性卒中发生相关［16］。

动脉粥样硬化是缺血性卒中的重要病因。有趣的是研究发现小鼠模型的颈动脉血流受到干扰时，DNMT 活性会增加，而抑制DNMT 会降低动脉粥样硬化病变的风险［17］。内皮功能障碍是动脉粥样硬化发展的早期特征，几项体外研究强调了DNA 甲基化在内皮功能障碍中的关键作用［18］。此外，研究表明血管细胞黏附蛋白1 的高表达可以促进动脉粥样硬化的发生，LINE基因的低甲基化会诱导血管细胞黏附蛋白1 表达增加，从而促进动脉粥样硬化发生，增加缺血性卒中的发病风险［19］。也有研究发现，在发生动脉粥样硬化的血管中，与血管生成和炎症相关的基因的甲基化CpG 岛的水平明显下降，这些变化导致叉头盒蛋白P1（forkhead box protein P1，FOXP1）的下调、晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGE）受体配体的上调以及 NOTCH1 和表皮生长因子样结构域 7（epidermal growth factor-like domain 7，EGFL7）的激活而它们是已知的参与调节动脉粥样硬化形成的重要因子［17］。

2.2 DNA甲基化/去甲基化与卒中的治疗 小鼠大脑中动脉闭塞后，大脑整体DNA 甲基化水平上升，这与DNMT活性增加有关，应用DNMT 抑制剂减轻了卒中的严重程度，延迟了缺血性脑损伤。Nandan 等［20］发现DNMT 抑制剂治疗通过上调金属蛋白酶组织抑制剂-2（tissue inhibitors metalloproteinases-2，TIMP-2）的表达来预防脑梗死后发生的线粒体功能障碍而发挥神经保护作用。Endres 等研究发现在大脑中动脉闭塞模型中，野生型（DNMT+/+）小鼠的DNA 甲基化水平显著增加，而转基因DNMT S/+小鼠则没有显示任何变化。大脑中动脉闭塞后的梗死体积和活细胞数的分析表明DNMT S/+小鼠的梗死体积减小和活细胞数增加。此外，在大脑中动脉闭塞的野生型（DNMT +/+）小鼠中，用5-氮杂-脱氧胞苷（5-aza-dC，一种DNMT 抑制剂）治疗后观察到病变体积减小［21］。另一种DNMT 抑制剂zebularine 在小鼠缺血性脑损伤实验中也被证实可以减轻脑水肿和血脑屏障的通透性，改善神经功能缺损［22］。近年研究发现小檗碱可以下调DNMT1 和DNMT3a 的表达，降低DNA 甲基化水平，对缺血再灌注损伤呈现保护作用［23］。

新证据表明TET 和5hmC 可以发挥神经保护作用。TET1保护神经元免受活性氧和caspase-3依赖的神经毒性，而TET1基因敲除动物的神经元对氧化损伤更敏感［24］。此外，TET2和5hmC耗竭会降低成年小鼠的神经元存活率，导致海马神经元生长受损和认知功能下降，而重建TET2即可减轻老年大脑的认知功能障碍［24］。同时，TET3在DNA损伤修复通路中发挥重要作用，可以触发损伤后的轴突再生，从而促进学习和记忆过程中的突触可塑性［24］。最近的研究已经确定抗坏血酸（维生素C）是一种表观遗传调节剂，它通过激活TET 酶参与DNA 中5hmC 的生成。卒中后应用抗坏血酸治疗可提高TET3活性和5hmC水平，减少梗死面积，促进运动和认知功能恢复［25］。

2.3 DNA甲基化/去甲基化与卒中的预后 DNA甲基化可能在卒中预后中发挥重要作用，尤其对中枢神经系统中多种细胞的命运至关重要。基础研究发现同型半胱氨酸对缺血性卒中神经发生的负面影响可能与DNA 甲基化有关。经同型半胱氨酸处理的缺血脑组织中，DNMT 的活性降低，DNA 呈现低甲基化，神经干细胞的自我更新能力受到抑制，这说明通过降低同型半胱氨酸水平来维持正常的DNA 甲基化，可能促进卒中后神经恢复和重建［26］。多项研究调查了DNMT 在突触可塑性机制中的重要性，DNMT 缺陷小鼠表现出记忆障碍和海马区突触可塑性降低［27］。血小板分泌的血小板反应蛋白1 是脑缺血期间诱导血管生成和神经修复所必需的炎症介质，在卒中后恢复过程中DNA 甲基化诱导血小板反应蛋白1 基因沉默会抑制神经恢复，加剧卒中损伤［8］。

而在临床研究中，基因甲基化与卒中预后的关系一直是研究热门。Natalia 等［28］发现EXOC4基因（主要参与调控胞吐作用、细胞生长胞质分裂和神经元发育等）的DNA 甲基化上调与卒中后较差的功能结局相关。一项研究对700 名卒中患者的表观基因组关联分析数据进行初步研究，分析了基因组中450 000 个CpG 岛，发现了一些CpG 位点的缺失，会通过调控转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）信号通路相关蛋白的表达、抑制细胞增殖等方式导致了卒中的不良预后［29］；而另一项研究测定了以DNA 甲基化为标志的生物年龄与卒中患者的不良预后密切相关［30］。最新一项研究发现NPPB基因启动子的高甲基化与卒中患者住院14 d或出院时的良好功能结局相关［31］。以上研究均提示DNA甲基化与缺血性卒中预后密切相关。

2.4 DNA甲基化/去甲基化与卒中的康复 卒中会导致长期神经功能缺损，因此卒中后的康复治疗成为卒中患者的治疗重点。卒中后任务导向训练对运动功能恢复的作用众所周知，但这种效果在一段时间内是有限的。因此，同时进行DNA 甲基化调控和任务导向训练，可以克服慢性期恢复的局限性。当DNMT 抑制剂5-aza-dC 与任务导向训练一起使用时，卒中后运动功能受损程度显著改善［32］。

生长抑制和DNA 损伤诱导因子 45β（growth arrest and DNA damage inducible protein 45 β，Gadd45β），一种活性DNA 去甲基化调节因子，介导的去甲基化可能调节神经的发生以响应外部的损伤信号［33］。Gadd45b 缺失的小鼠海马中神经祖细胞增殖和新生神经元的树突生长均存在缺陷，可能与神经发生相关基因启动子区无法发生DNA 去甲基化，从而引起成纤维细胞生长因子1 和脑源性神经营养因子的表达下降有关［34］。

MBD1对成人神经发生的研究表明，MBD1敲除小鼠的神经干细胞发育减少和基因突变增加［35］。海马齿状回在成年MBD1敲除小鼠中表现出神经发生减少和空间学习受损［8］。总体而言，这些结果表明DNA 甲基化和去甲基化精确地协调了神经的发生，对健康的神经祖细胞和大脑活动至关重要。然而，动态DNA 甲基化在神经发生中的作用的理解仍处于初级阶段，还需深入研究。

2.5 DNA甲基化/去甲基化与卒中的复发 DNA甲基化/去甲基化与缺血性卒中后血管事件的复发相关。多项研究旨在发现氯吡格雷治疗的缺血性卒中患者血管复发相关的差异甲基化位点。Li等［36］发现GANQ基因的低甲基化与氯吡格雷治疗的急性缺血性卒中患者缺血事件的高复发风险相关。另有研究报道ABCB1启动子区的低甲基化与CYP2C19*1/*1基因型的中国缺血性卒中患者对氯吡格雷的不良反应相关［37］。一项表观基因组研究表明，在接受氯吡格雷治疗的缺血性卒中患者中，TRAF3基因中cg03548645位点的低甲基化与血小板聚集增加和血管事件复发相关［38］。同一团队的另一项研究发现［39］，在接受阿司匹林治疗的患者中，PPM1A基因中cg04985020 位点的高甲基化与血管事件复发相关。Soriano 等［40］发现生物年龄（与年龄相关的DNA甲基化变化）是卒中复发的独立危险因素，卒中复发患者的生物学年龄明显高于无卒中复发的患者。

3 DNA 甲基化/去甲基化研究面临的挑战与对策

缺血性卒中患者的DNA 甲基化/去甲基化分析需要测试疾病的关键组织，但在实际研究中很难得到人类的脑组织样本或人类的血管样本。因此血液样本仍然是进行心脑血管疾病DNA 甲基化分析的良好选择。因为血液样本很容易获取，检测的侵入性很小，而且缺血性卒中的症状虽然以脑功能受损为特征，但根本上是血管病变引起大脑血液供应中断所致，而与脑组织本身病变无甚相关。Liu 等［41］指出，卒中受试者血液中的ACTB基因甲基化水平较低，这表明血液可用于识别与卒中相关的DNA 甲基化分子的变化。

DNA 甲基化/去甲基化在卒中的应用是一个新兴研究领域，它似乎在缺血性卒中不同阶段中起着重要作用，与卒中发生、治疗、复发和功能结局密切相关。DNA 甲基化/去甲基化可以将卒中的环境刺激转化为可逆的基因异常表达。但由于缺血性卒中病因的复杂性，目前研究还处于初级阶段，未来需要更多的研究，更大的样本量，更深入的国际合作探索缺血性卒中的DNA 甲基化/去甲基化变化和下游相关基因的表达，为研发调控DNA甲基化/去甲基化药物的临床转化提供新思路。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：李亚楠负责文献收集、撰写文章、论文修改；韩非原、王文、伍昊文负责文献收集；孙宏巍负责拟定写作思路、指导撰写文章并最后定稿。