m6A甲基化修饰与宫颈癌

丁瑶瑶 冲喜会 魏林珍综述 朱姣姣 张倩倩 陈 凡 秦天生审校

2018年全球癌症统计,宫颈癌被公认为第二大最常见的恶性肿瘤,其死亡率在女性中位居第二[1]。宫颈癌在中低收入国家的发病率和死亡率较高[2],其中印度(病例:97000,死亡:60000)和中国(病例:106000,死亡:48000)加起来占全球宫颈癌的三分之一以上[3]。尽管人乳头瘤病毒的疫苗和筛查广泛应用于临床,但临床中宫颈癌的诊断和治疗仍备受关注。

近几十年来,RNA的表观遗传调控已成为一个热门话题,RNA m6A修饰在癌症研究中已发展成为最热门的领域之一。表观遗传调控抑制剂,如氮胞苷和地西他滨,是DNA甲基化的两种抑制剂,在临床应用中显示出巨大的抗癌效果。在人类癌症中常发生m6A修饰的失调,其主要通过调控癌症基因表达来调节肿瘤细胞的生长行为和恶性程度。近年来许多研究表明异常的m6A修饰与宫颈癌进展和患者预后密切相关。Ma等[4]证明了13种主要的m6A RNA甲基化调节因子中在306个宫颈癌组织中根据不同临床病理特征分层的大多数中有不同的表达,并确定了两个宫颈癌亚组命名为RM1/2;与RM1相比,RM2的预后较差,总生存率(OS)较低,表明m6A RNA甲基化调节因子与宫颈癌密切相关,因此我们使用m6A RNA甲基化调节因子衍生出一种风险标记物,它不仅是一种独立的预后标记物,而且可以预测宫颈癌的临床病理特征。研究证明了METTL3和CD33+在宫颈癌中关系的综合结果,并揭示了METTL3在体外可诱导直接的髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关的MDSC分化;结果表明,这两种生物标志物都是预后的不良指标并且可能在宫颈癌的微环境中有重要作用,该研究可能为进一步研究METTL3在宫颈癌微环境中调节MDSC介导的免疫抑制机制提供线索[5]。因此,作用于m6A修饰调节因子可能是有希望且具有潜力的宫颈癌治疗靶点。

1 m6A

1.1 m6A的功能

N6-甲基腺苷(m6A)作为真核细胞mRNA中最常见的化学修饰之一,影响无数生命的过程,如在胚胎干细胞分化[6]、大脑发育[7]、突触可塑性[8]、造血[9]和癌症进展中起着关键作用[10]。N6甲基腺苷(m6A)修饰是mRNA21腺苷碱基第6个氮位的甲基化[11]。m6A甲基化可由甲基转移酶催化,如METTL3/14/16(“编写者”),由去甲基酶FTO和ALKBH5(“橡皮擦”)去除,并与m6A结合蛋白相互作用,如YTHDF1/2/3和IGF2BP1/2/3(“阅读器”)[11]。m6A修饰在由甲基转移酶或甲基转移酶操作的mRNA上是动态可逆的。总之,m6A书写器、擦除器和读取器的表达水平调节人类癌细胞中的RNA甲基化。可逆的RNA甲基化通过其对转录、剪接、mRNA稳定性和翻译速率的影响,调节癌细胞的基本特征[12]。

1.2 m6A在人类癌症中的作用

许多研究发现m6A甲基化与人类疾病的发生发展密切相关,尤其在人类癌症中对癌细胞的调节更为明显。在乳腺癌干细胞(BCSCs)中,NANOG mRNA中m6A的水平因缺氧依赖性ALKBH5上调而降低,从而提高了BCSCs的稳定性和NANOG蛋白水平[13]。将胶质母细胞瘤中的METTL3或METTL14基因敲除,使ADAM19、EPHA3和KLF4等几种癌基因的表达水平上调,而这几种癌基因在过度表达METTL3或METTL14的胶质母细胞瘤中表达水平下调;通过m6A免疫沉淀证实了ADAM19 mRNA的m6A水平的变化[14]。FTO是m6A的去甲基化酶,研究者发现通过降低mRNA转录物中的m6A水平,调控锚蛋白重复行列和含SOCS盒2(ASB2)和维甲酸受体α(RARA)等靶基因的表达,使白血病癌基因介导的细胞转化增强和白血病发生并抑制全反式维甲酸(ATRA)诱导的AML细胞分化;ASB2和RARA在正常造血过程中上调,是ATRA诱导白血病细胞分化的关键调节因子,表明FTO对ASB2和RARA表达的抑制有助于急性髓系白血病细胞对ATRA治疗的反应[15]。METTL14的敲除使RNA中m6A水平降低并增加了体内外的肿瘤转移,另外METTL14下降是肝细胞癌的不良预后因素;METTL14被证实与微处理器蛋白DGCR8相互作用,并以m6A依赖的方式积极调节初级microRNA-126过程。这项研究表明,RNA中的m6A模式参与了肿瘤生物学,METTL14和microRNA信号之间的相互作用可能指向HCC的一个可能治疗靶点[16]。在肝细胞癌中m6A调节器的去调节通过调节mRNA稳定性和翻译效率来调节不同下游靶点的表达,需要进一步的研究来解决m6A修饰和m6A调节因子在肝癌发展中的异质性和复杂性[17]。Fan等[18]研究发现METTL14在胃癌组织样本中下调,在体外和体内METTL14的异位表达显著抑制胃癌细胞的生长和侵袭,而METTL14的敲除具有相反的作用,circORC5确定为METTL14的下游靶点,METTL14的沉默降低了circORC5的m6A水平但增加了circORC5的表达,表明METTL14低表达是胃癌患者生存率低的一个预测因素。m6A由RNA甲基转移酶METTL3、METTL14和METTL16(编写者)催化,被去甲基酶FTO和ALKBH5(清除器)去除,并与m6A结合蛋白相互作用,如YTHDF1和IGF2BP1(读取器),RNA甲基转移酶、去甲基化酶和M6A结合蛋白在多种器官来源的人类癌症组织中经常上调,增加癌转录物和癌蛋白表达、癌细胞增殖、存活、肿瘤起始、进展和转移[11]。Huang等[19]分析了转移性骨肉瘤中21种m6A RNA甲基化调节剂的表达和预后价值,并利用RBM15沉默和过度表达前后的体外细胞学实验以及体内转移模型进一步验证了这些调节剂,发现m6A RNA甲基转移酶RBM15在骨肉瘤的发生和转移中起关键作用。Shen等[20]首次深入了解了m6A修饰的lncRNA在透明细胞肾细胞癌中的功能和机制,并确定了透明细胞肾细胞癌进展中的“METTL14-YTHDC1-Lnc-LSG1”调节轴,强调了METTL14和lncRNA m6A修饰在透明细胞肾细胞癌发展中的重要作用。以上研究充分说明了m6A在人类癌症中的重要影响,因此为了遏制癌症对人类生命的威胁需要进一步对其进行研究。

2 m6A在宫颈癌中的作用机制

m6A RNA修饰通过调节RNA转录、剪接、加工、翻译和衰变发挥作用,并参与多种恶性肿瘤的发生和转移。Geng等[21]研究发现METTL14的下调抑制了SiHa和C33a细胞的增殖、迁移和侵袭能力,沉默METTL14可诱导宫颈癌细胞的细胞周期停滞;METTL14基因敲除通过降低Akt和mTOR的磷酸化来抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,并且下游凋亡相关蛋白的表达也受到影响,这些数据表明METTL14在HPV阳性和HPV阴性宫颈癌细胞的生长和侵袭中起着重要的致癌作用。Li等[22]研究证明m6A可以通过调节PDK4来调节癌细胞的糖酵解,5′UTR的甲基化对m6A介导的mRNA稳定性和翻译至关重要;由于大量基因参与细胞代谢,不能排除m6A修饰通过间接靶向其他基因来调节代谢过程的可能性,该研究表明,m6A通过诱导PDK4调节宫颈癌的糖酵解。METTL3在宫颈癌组织和细胞中显著上调,这与宫颈癌患者的淋巴结转移和不良预后密切相关[23]。Wang等[23]研究发现了METTL3在宫颈癌致癌和糖酵解效应中的关键作用,m6A修饰的HK2 mRNA受m6A读取器蛋白YTHDF1调节,该蛋白识别m6A并增强靶转录物的稳定性,METTL3招募YTHDF1来调节HK2 mRNA的稳定性,通过加速糖酵解,通过YTHDF1/HK2轴发挥致癌作用,从而为宫颈癌提供一个潜在的预后生物标志物。Wang等[24]发现YTHDF1在宫颈癌中高表达,并且与宫颈癌患者的不良预后密切相关。YTHDF1基因敲除抑制宫颈癌细胞的生长、迁移和侵袭并诱导其凋亡,也抑制了宫颈癌细胞在体内的肿瘤发生。通过对YTHDF1基因敲除后RIP-seq、meRIP-seq和Ribo-seq的联合在线数据分析,RANBP2被确定为YTHDF1在宫颈癌细胞中的关键靶点;YTHDF1以m6A依赖的方式调节RANBP2翻译而不影响其mRNA表达,RANBP2促进宫颈癌细胞的生长、迁移和侵袭,该研究说明通过调节的表达证明了YTHDF1在宫颈癌中的致癌作用。E6/E7可以通过IGF2BP2介导的m6A-MYC mRNA在体外和体内的调节来调节宫颈癌细胞的有氧糖酵解。细胞代谢是一个涉及众多基因活性的复杂过程,不能排除E6/E7也可能通过以IGF2BP2依赖的方式影响miRNA(而非MYC)的甲基化状态来靶向有氧糖酵解[25]。Hu等[25]人发现HPV E6/E7/IGF2BP2/m6A MYC/糖酵解轴可能在宫颈癌的发病机制中起关键作用,这表明靶向HPV E6/E7及其下游通路可能是治疗该癌症患者的一个有吸引力的治疗选择。N6-甲基腺苷(m6A)异常修饰影响宫颈癌细胞的发生、发展和预后,异常的m6A调节因子可能确定为治疗宫颈癌新的药物靶点。

3 RNA靶向m6A在宫颈癌治疗中的潜力

随着表观遗传学和分子生物学的发展,新型m6A甲基化修饰越来越受到关注。近年来,许多研究说明了m6A可能与lncRNA一起参与宫颈癌的发病机制。Wang等[26]研究发现与邻近正常组织相比,宫颈癌组织中GAS5-AS1的表达显著降低,且GAS5-AS1的下调与晚期FIGO分期、远处转移、淋巴转移和不良预后显著相关。GAS5-AS1在体外显著降低宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,在体内显著抑制宫颈癌的致瘤性和转移;GAS5-AS1与肿瘤抑制因子GAS5相互作用,并通过与RNA去甲基化酶ALKBH5相互作用和减少GAS5 N6甲基腺苷(m6A)修饰来增加其稳定性,m6A介导的GAS5 RNA降解依赖于m6A读取器蛋白YTHDF2依赖的途径;因此研究者发现了宫颈癌癌变和转移中表观遗传学改变的一个重要机制。ZFAS1在宫颈癌组织中显著上调,ZFAS1的升高与晚期FIGO分期、淋巴结和远处转移相关,也表明宫颈癌患者的总体生存率较低[27]。Yang等[27]研究发现ZFAS1在体外促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭,在体内促进肿瘤生长和转移;ZAFS1隔离了miR-647,这种RNA-RNA相互作用受METLL3介导的m6A修饰的调节。以上研究说明ZFAS1及其m6A修饰在宫颈癌细胞中的功能作用,并表明ZFAS1可能是宫颈癌治疗的一个有希望的靶点。研究发现lncRNA KCNMB2-AS1在宫颈癌中显著过度表达,并与不良预后相关,KCNMB2-AS1的缺失显著抑制宫颈癌细胞增殖并诱导凋亡[28]。体内异种移植模型显示敲除KCNMB2-AS1明显延迟肿瘤生长; KCNMB2-AS1作为竞争性内源性RNA大量海绵状miR-130b-5p和miR-4294,导致IGF2BP3的上调,IGF2BP3是宫颈癌中一个已被证实的癌基因,其能够通过KCNMB2-AS1上的3个N6甲基腺苷(m6A)修饰位点结合KCNMB2-AS1,其中IGF2BP3充当m6A“读取器”并稳定KCNMB2-AS1;因此,KCNMB2-AS1和IGF2BP3形成了一个正调节回路,扩大了KCNMB2-AS1在宫颈癌中的致瘤作用[28]。FOXD2-AS1在宫颈癌细胞和组织中的表达显著上调,这与不良预后密切相关[29]。在功能方面,功能获得和功能丧失分析显示FOXD2-AS1促进宫颈癌细胞的迁移和增殖,FOXD2-AS1沉默抑制了体内肿瘤的生长;m6A甲基转移酶-甲基转移酶样3(METTL3)增强了FOXD2-AS1的稳定性并维持其表达;FOXD2-AS1将赖氨酸特异性去甲基酶1(LSD1)招募到p21的启动子区域,以抑制其转录丰度;以上研究说明了METTL3/FOXD2-AS1通过m6A依赖方式加速宫颈癌的进展[29]。研究表明miR-193b较低的表达与更晚期的宫颈癌分期和更深的间质浸润密切相关[30]。miR-193b是一种肿瘤抑制因子,受宫颈肿瘤中m6A甲基化的调节,METTL3以m6A依赖的方式调节miR-193b成熟过程,通过CCND1靶向在体内和体外重新引入miR-193b可显著抑制宫颈癌细胞的增殖,说明m6A相关的miR-193b下调通过靶向CCND1促进宫颈癌的侵袭性[30]。Ji等[31]研究发现新的m6A修饰的circRNA(circARHGAP12,hsa_circ_0000231)在宫颈癌组织和细胞中上调,circARHGAP12的m6A修饰可以放大其富集;实验表明circARHGAP12在体内外均促进了宫颈癌的进展,MeRIP-Seq表明FOXM1 mRNA中有一个显著的m6A位点,CircARHGAP12与m6A读取器IGF2BP2相互作用与FOXM1 mRNA结合,从而加速FOXM1 mRNA的稳定性;该研究说明circARHGAP12通过m6A依赖IGF2BP2/FOXM1途径在宫颈癌进展中发挥致癌作用。Chen等[32]研究了hsa_circ_0000069(circ0000069)对宫颈癌的促瘤作用及其作用机制,发现circ0000069在宫颈癌细胞和组织中上调,N6-甲基腺苷(m6A)修饰保持了circ0000069的稳定性,circ0000069促进颈癌细胞增殖和迁移;miR-4426特异性结合circ0000069并介导其在宫颈癌发育中的功能,circ0000069部分上调是由于m6A修饰,其通过宫颈癌中的海绵状miR-4426促进细胞增殖和迁移。piRNA-14633在宫颈癌组织和细胞中高表达,piRNA-14633模拟物(piRNA-14633过度表达)促进CaSki细胞和SiHa细胞的存活、增殖、迁移和侵袭,piRNA-14633模拟增加了m6A RNA甲基化水平和METTL14 mRNA稳定性;METTL14是piRNA-14633的定向靶基因,用siRNA敲除METTL14可减弱宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭;piRNA-14633增加了CYP1B1的表达而METTL14的沉默削弱了其表达。piRNA过度表达对METTL14表达的影响具有浓度依赖性,体内实验结果表明piRNA-14633促进宫颈肿瘤生长,说明piRNA-14633通过METTL14/CYP1B1信号轴促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,突出了piRNA-14633在宫颈癌中的重要作用[33]。以上研究说明了m6A修饰和RNA在宫颈癌中的共同作用影响了宫颈癌细胞的增殖、侵袭、迁移,因此我们可以通过以上的结果进行进一步研究,通过调节m6A和RNA之间相互作用的途径来阻碍宫颈癌的发生和发展。

综上,m6A书写器、擦除器和读取器的表达水平调节人类癌细胞中的RNA甲基化情况,可逆的RNA甲基化通过对转录、剪接、mRNA稳定性和翻译速率的影响,调节癌细胞的基本特征[12]。在宫颈癌中,m6A修饰促进了癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及肿瘤的恶行性。另外,研究应该集中在m6A甲基转移酶METTL3、METTL14和METTL16及其伙伴蛋白、去甲基酶FTO和ALKBH5以及m6A阅读器YTHDF1-3、YTHDC1-2和IGF2BP1-3的致癌作用机制上,以便为靶向治疗提供新的、更具体和有效的策略[11]。另外,m6A调节因子在肿瘤免疫治疗和免疫逃避中被广泛研究。肿瘤免疫治疗是最有前途的治疗策略,m6A修饰介导的免疫侵袭成为妇科肿瘤发病机制和预后研究的热点[34]。然而,m6A修饰在妇科肿瘤中介导的免疫侵袭的研究仍处于起步阶段,在未来的研究中,m6A修饰有望在这一领域取得新的突破[34]。因此,把m6A修饰酶或者靶向的RNA作为研究靶点,阻断或者沉默其研究靶点将是宫颈癌有力的潜在治疗策略。我们相信在不久的将来,越来越多的新型、特异、有效的m6A修饰抑制剂和激活剂将被开发并批准用于临床。