基于基因检测和血药浓度监测技术优化肝移植术后他克莫司个体化给药方案

宗慧颖,张云迪,李越,李妍

(1.山东中医药大学,山东 济南 250355;2.山东第一医科大学第一附属医院<山东省千佛山医院>,山东 济南 250014)

肝移植是治疗终末期肝病最有效的手段之一,患者在移植术后需长期接受免疫抑制治疗以免出现免疫排斥反应,目前钙调磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitor,CNI)+霉酚酸类药物+糖皮质激素是肝移植术后患者广泛应用的三联免疫抑制方案。他克莫司是临床最为广泛应用的CNI类药物,存在治疗窗窄、个体间药动学差异大等特点,其血药浓度较低时可能增加急性排斥(acute cellular rejection,ACR)的风险,而高血药浓度可能诱发药物毒性的发生。临床建议他克莫司个体化用药分为起始剂量和维持剂量两个阶段,以基因检测技术预测起始剂量,之后根据治疗药物监测(therapeutic drug monitoring,TDM)结果对维持剂量进行调整[1],以此优化用药疗效,可在一定程度上控制个体间的变异性。研究发现,参与他克莫司药动学过程的代谢酶、转运体等编码基因的多态性是导致其血药浓度出现个体差异的重要因素,但目前国内外研究结论尚不一致。此外,肝移植术后使用TDM来指导他克莫司给药时,由于他克莫司的给药前浓度(谷浓度,C0)与其曲线下面积(AUC)相关,故推荐监测他克莫司的C0作为剂量调整依据,然而C0预测的准确性低于AUC,测定给药间隔内的AUC是反映他克莫司暴露的最佳指标,但临床上得到完整的AUC值是不切实际的。寻找更有预测价值且便捷的疗效预测指标,对于他克莫司的个体化治疗有重要意义。

因此,本文围绕血药浓度监测和药物基因检测(药物代谢酶、转运蛋白等编码基因)两大技术在指导他克莫司个体化用药中的应用进行综述,比较各种预测指标之间的优劣,为临床制定肝移植术后他克莫司个体化给药提供参考依据。

1 他克莫司血药浓度监测在肝移植个体化给药中的价值

1.1 传统谷浓度C0监测在肝移植个体化给药中的价值他克莫司的C0作为监测其血药浓度最常用的方法,采血时间准确与否直接影响他克莫司血药浓度的真实性,即应在早上服用他克莫司半小时内采血以监测血药谷浓度。C0因更容易获得且与药效相关性良好,是目前最为广泛应用的血浓监测方案。有研究表明,他克莫司的C0和AUC之间的相关系数r大于等于0.7时是可以接受的[2],如r值过低则认为两者相关性不理想,对于这些患者使用C0作为疗效的预测因子可能会出现偏差。对于无并发症且年龄在60岁以下的成年肝移植患者,他克莫司的理想浓度参考如下:术后1个月内目标全血谷浓度为10～15 ng·mL-1,第2～3个月为7～11 ng·mL-1,3～6个月为6.0～10.0 ng·mL-1,6个月～1年为5～8 ng·mL-1,1～2年为3～5 ng·mL-1,2年后理想谷浓度为2～5 ng·mL-1并维持[3]。

然而问题在于,部分患者测定的C0值处于正常水平,但他克莫司真正的体内暴露量并不充分;相反,患者的C0也有可能超出目标范围,而其体内的药物暴露(通过AUC测量)实际上是理想的。有学者对16名肾移植患者术后服用他克莫司的药代动力学做了研究,主要指标为他克莫司的C0以及AUC,结果证实C0在目标范围内,但仍有3例患者因药物暴露不足而出现急性排斥反应[4]。此外,C0同时受到其他因素的影响,如一项基于联合用药的移植患者数据表明,患者在接受吗替麦考酚酯与他克莫司或环孢素联合用药时,C0容易受到联合用药的影响。相比之下AUC0～12是更合适的评估方法[5],AUC下的面积被认为是与临床效果最相关的PK暴露参数。因为对于他克莫司,都是间隔12 h服药1次。如果要准确评估药物在12 h内总的有效剂量,就需要计算12 h内的AUC。然而,要确定整个12 h内的 AUC 值,往往需要在9～12个时间点采集血液样本,这使得检测费用昂贵、过于复杂,而且由于血液样本数量较多,患者无法接受。

尽管采集全血来测定他克莫司浓度的方法已被临床广泛应用,但仍有部分患者的治疗效果不能被准确预测。这一现象提示,有必要在监测血药浓度的基础上,开发其他更能准确反映他克莫司药效的生物标志物。

1.2 组织和外周血单核细胞浓度监测在肝移植个体化给药中的价值根据2017年由国际治疗药物监测和临床毒性协会发布的《他克莫司个体化治疗药物监测更新的第二共识报告》表明,对同种异体移植物组织内的他克莫司浓度进行检测,可以更好地了解移植术后受者体内他克莫司的分布。测量他克莫司直接进入的作用部位(即淋巴细胞,或外周血单核细胞(PBMC),即富含淋巴细胞的分数)的浓度可用以完善治疗药物监测策略,有望更准确预测其疗效[6]。在肝移植受者中,他克莫司的淋巴细胞内浓度实际上与外周血单核细胞浓度(CPBMC)接近,已被认为与全血他克莫司谷浓度相比,与药物的免疫抑制作用更直接相关[7]。Capron等[8]表明CPBMC与肝移植后他克莫司浓度之间存在良好的相关性(r2=0.55)。尽管对PBMC和异体移植组织作为他克莫司TDM的替代基质的研究已经进行了20多年,但在预测排斥反应方面几乎当前并没有一致的证据证明其临床益处。与全血一样,PBMC是异质细胞集合,它们的使用可能与全血的使用存在类似的局限性[9]。此外,数据缺乏标准化、活检细胞的多样性、基质效应的影响、血液污染等都是临床还没有将组织中浓度监测应用到常规的实践中的原因。

1.3 有限采样策略在肝移植个体化给药中的价值测定给药间隔内的AUC通常是反映他克莫司暴露的最佳指标。然而通过多次取血而得到完整的AUC值可行性较差,这限制了其在临床上的使用;基于少数取血时间点的有限采样策略(limited sampling strategy,LSS)是一种对患者较为友好的替代方案,LSS利用在2～4个时间点测量的他克莫司浓度来估计AUC,其临床可行性优于完整12 h AUC中≥8个时间点的方案[10]。有研究证实完整AUC与LSS的相关系数良好,r≥0.90[11],提示LSS方案可在一定程度上替代AUC。在一项首次使用非线性混合效应建模描述肝移植接受者中他克莫司群体药代动力学的研究中,通过系统评估认为最好的4点LSS是t=0、3、6、8 h和t=0、3、6、12 h,最好的3点LSS是t=0、4、8 h[12]。一项在肝肾移植患者中他克莫司个体化使用的研究表明,最佳LSS是取t=0、8、12 h几个时间点[13]。另有一项实验应用贝叶斯法评估了以0和3 h他克莫司血浓得到的AUC和标准AUC0-12,得到两者之间相关性良好,r2=0.96,可见这一方法精确度较高[14]。临床实践中,可以选择疑为他克莫司C0和AUC之间相关性较低的患者,即尽管C0在目标范围内,但仍出现毒性或ACR的患者,可应用LSS来制定给药方案。总之,由于患者个体间差异大,将患者药物浓度保持在目标治疗范围或窗口内的剂量个体化新方法仍需进一步探索。

2 他克莫司相关基因检测在肝移植个体化给药中的价值

2.1 药物代谢酶基因细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)是哺乳动物最主要的Ⅰ相药物代谢酶,能够对多种药物进行生物转化。CYP3A是CYP450超家族中表达最丰富、活性最高的酶,分为CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7等亚型[15]。CYP3A7仅在胎儿肝脏中表达,只有CYP3A4和CYP3A5被认为与成人相关,他克莫司即通过肝脏和肠壁中的CYP3A4和CYP3A5酶进行代谢。CYP3A4基因位于染色体7q21.1-22.1上,基因长度约为27 kbp,呈高度多态性表达,迄今为止至少已鉴定出40个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)[16],既往研究已经表明部分SNP与他克莫司的药代动力学相关[17-19]。目前已发现CYP3A5等位基因达25种以上,其中最具有功能意义的是CYP3A5*3(rs776746),CYP3A5*3位于CYP3A5基因的3号内含子中,CYP3A5rs776746多态性是与他克莫司药代动力学相关的最著名的发现[20],是CYP3A5SNPs中研究最多、最常见的类型。

他克莫司的去甲基化代谢反应主要由CYP3A4和CYP3A5酶介导。CYP3A4和CYP3A5之间存在高度的序列同源性,导致它们之间存在底物重叠,因此在临床使用他克莫司时,有必要对CYP3A4和CYP3A5基因型进行联合分析。CYP3A4*18B在中国人群中的最小基因频率为30.8%,是已知中国人突变率最高的一个CYP3A4位点[21],然而CYP3A4*18B与CYP3A5*3等位基因间存在连锁不平衡,且有研究表明消除CYP3A5*3影响后CYP3A4*18B各基因型组间他克莫司的C0/D并不具备显著性差异,这可说明CYP3A4*18B并不能单独影响他克莫司的血药浓度[22]。另有研究表明,CYP3A4*1B基因多态性与CYP3A4酶活性增强有关,相比CYP3A4*1B携带者(CYP3A4*1/*1B型或CYP3A4*1B/*1B型),CYP3A4*1/*1型和CYP3A4*22患者他克莫司日剂量需求更低[23]。但因为CYP3A4*1B等位基因频率的分布呈现明显的种族差异,在亚洲人群中突变几率近乎为零[18],所以CYP3A4*1B对中国肝移植患者他克莫司血药浓度几乎没有影响,因此认为根据中国患者CYP3A4基因多态性来调整他克莫司给药方案不具有意义。

CYP3A5*3突变会引起终止密码子提前,导致酶失活,因此CYP3A5*3是造成肝移植受者他克莫司药代动力学个体间差异的主要原因。根据他克莫司的代谢率,CYP3A5*1(CYP3A5*1/*1)纯合子携带者为快代谢者,杂合子CYP3A5*1/*3、CYP3A5*1/*6或CYP3A5*1/*7为中代谢者,纯合突变携带者CYP3A5*3(CYP3A5*3/*3)、CYP3A5*6(CYP3A5*6/*6)或CYP3A5*7(CYP3A5*7/*7)作为弱代谢者[24]。这些等位基因的分布因患者的种族而异,美籍黑人的CYP3A5*1等位基因频率为85%,亚洲人为56%,而西方人(白人为主)频率为16%,可以得出亚洲人他克莫司药物代谢率高于西方人而低于美籍黑人[25]。Shi等[18]进行的一项涉及216名中国肝移植受者的试验得出结论,CYP3A5*1/*1基因型受者的他克莫司每日剂量需求高于*3/*3基因型者,与CYP3A5*3基因型的受者相比,CYP3A5*1型的浓度/剂量比最低。因此,快代谢者对CYP3A5底物有更高的清除率及更低的生物利用度,同等剂量给药比其他基因型疗效较差。

此外,在肝移植中,供体肝的CYP3A5基因型可能与受体肠的CYP3A5基因型不同。在确定剂量时,需要考虑供体和受体双方的基因型。Dong等[26]通过对138名来自中国的肝移植受者和供者的CYP3A4(rs2242480和rs4646437)基因型进行分类,研究对肝移植患者他克莫司早期浓度的影响,结果表明受体CYP3A4多态性相对于供体显示更大的贡献度。然而,迄今为止,关于供体和受体基因型的相对影响,以及供体肝脏和受体肠道基因型是否在移植后的不同时间点发挥作用的研究尚无明确定论。Barrera-Pulido等[27]对53名肝移植受体和供体基因型进行分类,结果显示在移植后的早期,受体和供体基因型均为CYP3A5*1/*3的患者给予正常剂量药物时,他克莫司的血药浓度未能达到最低水平。在第30天和第60天之间,受体和供体基因型均为CYP3A5*3/*3的肝移植受者相比较于其他基因型需要更低剂量的他克莫司。在一项旨在评估肝移植供体和受体基因型对他克莫司C0/D影响的荟萃分析中,结果显示供体和受体CYP3A5基因型均能影响他克莫司C0/D比值,CYP3A5*3/*3基因型与*1/*1和*1/*3基因型相比,供体和受体的C0/D值均升高。因此认为如果供体或者受体具有CYP3A5*1等位基因,则达到最佳谷水平所需他克莫司剂量会更高。

2.2 药物转运蛋白相关基因多态性他克莫司的吸收和代谢受到转运蛋白(由ABCB1基因编码)活性的影响,ABCB1的单核苷酸基因多态性通过编码P-gp而影响他克莫司的药代动力学,它的功能是作为跨膜外排泵,将底物从细胞内向外输出,以防止细胞积聚。在患者小肠中表达的P-gp能将他克莫司这一类疏水性分子药物外排出小肠细胞,影响机体对他克莫司的吸收。

研究表明,ABCB1可能影响他克莫司的吸收、分布和排泄[28]。目前研究侧重于评估ABCB1基因多态性(1236 C>T、rs1128503;2677 G>T/A、rs2032582和rs1045642、3435 C>T)与他克莫司血药浓度之间的关系。一项评估ABCB1基因多态性对巴基斯坦肝移植受者他克莫司剂量和不良反应的影响研究中,研究人员对移植受者3个ABCB1SNP(rs1045642、rs2032582和rs1045642)进行基因分型,后续通过监测急性细胞排斥反应、败血症和其他不良事件,结果表明rs1045642基因多态性可缩短他克莫司达到最佳剂量的时间,rs2032582和rs1045642基因多态性可能预测他克莫司不良反应的发生[29]。Hashida等[30]研究发现,肝移植术后肠道ABCB1的mRNA表达水平与他克莫司C0/D值显著相关。这提示肠道P-gp的表达水平差异可能是患者个体化给药的重要参考因素之一。目前国内外都有ABCB1基因多态性与血液中他克莫司水平相关的报道,但这种关联性之间存在一定争议。有研究[31]认为ABCB1基因多态性并不能通过P-gp的表达而影响他克莫司的血药浓度,而另有研究[32]则认为ABCB1基因多态性会影响他克莫司的血药浓度,且供体中的ABCB1DNA甲基化对肝移植后他克莫司血药浓度的个体差异有显著影响,提示供体肝脏中的ABCB1DNA甲基化可能是影响肝移植后他克莫司血药浓度的一个重要表观遗传因素。

2.3 基于基因多态性的个体化给药建议CYP3A4*1B和CYP3A4*22在亚洲人群中的突变率几乎为零[30],所以常规检测该基因突变在中国肝移植患者中的实际临床意义有限。CYP3A4*18B虽然是中国人群中突变率最高的一个基因位点,但尚无明确证据表明CYP3A4*18B基因多态性可以作为独立因素影响他克莫司在患者体内的代谢。有关CYP3A5*3基因型对肝移植术后他克莫司血药浓度产生影响的给药剂量,国内外推荐较为一致。虽然没有直接证据表明根据CYP3A5*3基因指导肝移植他克莫司用药能提高临床疗效,但临床药物遗传学实施联盟指南在已知CYP3A5基因型的情况下提供了他克莫司的给药建议,表1总结了基于CYP3A5表型以及与等位基因变异相关的治疗建议汇总。

表1 基于CYP3A5双倍型的可能表型分配及给药建议

总的来说,尽管剂量暴露关系随时间而变化,CYP3A5*3/*3基因型肝移植患者的剂量校正他克莫司谷浓度比CYP3A5*1/*1或*1/*3基因组型患者高1.5至2倍。

目前ABCB1基因多态性影响他克莫司药代动力学的具体机制仍不清楚,无法利用ABCB1基因型调整他克莫司用药剂量。因此,不同患者ABCB1不同位点的不同突变与他克莫司药代动力学之间的关系需要更多研究来确定。

基因分型是否应该成为移植的标准做法仍然是一个问题,因为需要多因素方法来评估药物的药代动力学概况。即使在具有相同基因型的患者中,也观察到他克莫司给药需求以达到目标血液水平的广泛变化。这是因为遗传多态性只是影响他克莫司药代动力学的可能因素之一。患者的年龄、种族、代谢水平、伴随的药物和其他各种环境因素在改变药物药代动力学方面似乎比基因型发挥着更重要的作用。特别是在肝移植患者中,移植后的时间在改变药物代谢和分布方面也起着关键作用。

3 总结与展望

关于他克莫司血药浓度和药物遗传学之间的相关性非常复杂,已发表的文章主要集中于编码代谢酶和转运蛋白的基因的多态性,结论主要为CYP3A4、CYP3A5和P-gp对他克莫司的药代动力学可能产生影响。虽然以一点取血预测药效存在偏差,但他克莫司C0监测仍是肝移植后的标准推荐方法。对于部分他克莫司C0在治疗范围内仍出现ACR或排斥反应的患者,可考虑实施简化的AUC(如LSS)。他克莫司最佳的用药剂量和血药浓度可能会受很多因素的影响,年龄、基因型差异、肝功能因素及药物相互作用等都会对其产生一定的作用。

临床实践中,应综合考虑患者的经济情况、疾病情况等选择是否对其进行基因检测,同时考虑不同的基因型对患者的他克莫司代谢带来的影响,根据患者术后用药的表达情况来进行常规治疗药物监测,为他克莫司使用制定更合理的个体化给药方案,从而维持的正常器官功能。