基于网络药理学和分子对接探究山楂治疗高脂血症的作用机制

何明媚,高静云,贺美婷,潘海峰

(承德医学院河北省中药研究与开发重点实验室,河北 承德 067000)

高脂血症(hyperlipidemia,HLP),常被称为高血脂,医学上也称为血脂异常(dyslipidemia),通常指血浆中甘油三酯(TG)和(或)总胆固醇(TC)升高,包括低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。HLP分为原发性和继发性两类。原发性与先天和遗传有关,是由基因缺陷,参与脂蛋白转运和代谢的受体、酶或载脂蛋白异常,或由环境或未知因素引起;继发性多发生于代谢性紊乱疾病(糖尿病、高血压等),或与年龄、饮食、精神、情绪活动等其他因素有关。临床上表现为真皮内脂质沉积引起的黄色瘤和脂质在血管内皮沉积引起的动脉硬化。目前,现代医学治疗HLP的药物以降低TC和LDL-C为主的有他汀类和树脂类,以降低TG为主的有贝特类和烟酸类[2-3]。这几类西药都有一定的降脂作用,但对于一些不耐受降脂药的患者长期服用后可能会出现肌肉疼痛或肝肾损伤,甚至死亡。相比西药,中药在改善高脂血症方面有一定优势,中医治疗高血脂的药物如山楂、茯苓、丹参和泽泻等副作用较小,对人体的损害相对减少[4-5]。随着现代医学的进步,中医中药在调节血脂方面的作用日益突出,中药治疗高脂血症的研究也备受关注。

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge),蔷薇科山楂属,分布于河北、山东、河南等地。性味酸甘,微温。具有降血脂、降血压、强心和抗心律不齐等作用,也是健脾、开胃、消食、活血化痰的良药,对胸膈脾满、血淤、闭经等症状有很好的疗效[6]。山楂中的有效成分有机酸、黄酮是其发挥药理作用的重要物质基础,能抑制肝脏胆固醇的合成,促进肝脏对血浆中胆固醇的吸收,从而起到降血脂的作用。研究发现山楂黄酮可显著降低实验性高血脂动物的TC、LDL-C和载脂蛋白的浓度,显著升高HDL-C和载脂蛋白浓度,但对TG影响较小。山楂黄酮还可降低动脉粥样硬化(AS)发生的风险,起到预防AS的作用[6]。

网络药理学是在系统生物学理论的基础上,通过网络对生物系统进行分析,选择特定信号节点进行多靶点药物分子设计的一门新兴学科。分子对接是通过受体的特征以及受体和药物分子之间相互作用的方式来进行药物设计,主要研究分子间(如配体和受体)相互作用,并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法[7]。本文基于网络药理学,采用分子对接技术探究山楂治疗高脂血症的作用机制,为后续山楂治疗高脂血症的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 山楂成分的收集和靶点预测以“山楂”或“shanzha”为检索词在HERB、ETCM、SymMap和BATMAN-TCM等数据库获得山楂所有的化学成分并去重,再去除同分异构体。将筛选出的山楂的各个成分输入PubChem数据库获得每个成分的SMILE结构,导入SwissTargetPretiction数据库,预测出各个成分对应的靶点。最后利用UniProt数据库将靶点基因进行标准化[8-9]。

1.2 高脂血症靶点的收集以“hyperlipemia”为检索词,分别在GeneCards和OMIM数据库收集疾病的相关靶点并去重,通过Uniprot数据库将靶点基因进行标准化[10]。

1.3 山楂-高脂血症交集靶点的收集取山楂和高脂血症的共同靶点,作为山楂治疗HLP的潜在靶点,利用Venny 2.1在线工具绘制韦恩图[11]。

1.4 PPI网络的构建与核心靶点的收集将交集靶点导入STRING数据库设置物种为“Homo sapiens”,最低相互作用评分设为0.4,删除游离节点,获取PPI网络图,将其tsv文件导入Cytoscape 3.9.1软件。使用Centiscape 2.2插件进行网络拓扑分析,选取两轮操作均满足大于度中心性“Degree Centrality,DC”、接近中心性“Closeness Centrality,CC”和介数中心性“Betweenness Centrality,BC”这3个参数的节点作为关键靶点,构建关键靶点的网络拓扑图。将准备好的成分-靶点的数据与属性文件导入Cytoscape 3.9.1软件,构建成分-靶点的网络拓扑图[12]。

1.5 GO生物过程和KEGG信号通路富集分析将山楂-高脂血症交集基因提交到DAVID数据库,选择物种为智人“Homo sapiens”,进行GO和KEGG富集分析,获得生物过程(BP)、细胞成分(CC)、分子功能(MF)和关键信号通路的富集信息,借助微生信网站绘制相关分析图[13-14]。

1.6 分子对接验证将与山楂防治HLP相关的6个活性成分和12个关键靶点进行分子对接。从PDB、PubChem数据库获取受体蛋白和配体的结构文件,通过阅读相关文献选择合适的受体蛋白,运用Open Babel GUI、AutoDockTools-1.5.7软件对受体蛋白和小分子配体进行预处理,获得相应的pdbqt文件,确定活性口袋位置,设置对接参数。运行AutoDockTools-1.5.7软件进行分子对接,通过PyMOL软件将对接结果可视化,获得相应的对接结果模式图[15]。

1.7 基因在正常人体的组织分布情况通过BioGPS数据库收集山楂-高脂血症靶基因中的188个交集基因在正常人体组织的分布信息,计算各组织器官表达量的平均值和平均值的中位值,筛选大于中位值的组织器官,分析处理数据,利用Cytoscape 3.9.1软件绘制交集基因在与HLP相关组织器官上的分布图[16-17]。

2 结果

2.1 确定山楂有效成分和靶点HERB、ETCM、SymMap和BATMAN-TCM等数据库中检索到山楂所有的化学成分274个,去除重复项和同分异构体后,筛选出有效成分69个(见表1)。通过PubChem数据库获得各个成分的SMILE结构,用SwissTargetPretiction数据库预测出各个成分对应的靶点并将其标准化,即将蛋白质名称(UniProt KB)统一为基因名,得到628个与山楂化学成分相关的基因。

表1 山楂的有效成分

2.2 确定高脂血症靶点检索“hyperlipemia”,在GeneCards和OMIM数据库中搜集所有与HLP相关的靶基因,删除重复基因后得到1 552个,再用UniProt数据库将基因标准化。

2.3 获得山楂-高脂血症交集靶点及韦恩图1 552个HLP靶点与山楂活性成分的628个靶点取交集,得到188个交集基因即山楂治疗HLP的潜在作用靶点,使用Venny 2.1在线工具绘制成分-疾病靶点韦恩图(见图1)。

图1 成分-靶点韦恩图

2.4 构建PPI 网络与核心靶点将188个交集靶点导入STRING数据库,分析得到PPI蛋白互作网络,筛选出12个关键靶点,绘制其网络拓扑图(见图2)。图中节点代表靶点,连线表示节点之间的关系,连线越多靶点关系越密切,靶点大小随度值大小而变化,度值越大节点越大,与山楂治疗HLP的相关性越大,由关键靶点的网络拓扑图可知AKT1、TNF和IL-6等基因可能与治疗HLP高度相关。将成分-靶点的数据与属性文件导入Cytoscape 3.9.1软件,绘制成分-靶点的网络拓扑图(见图3),通过构建PPI网络得到35个化学成分与188个交集靶点有连线,即这35个成分与治疗HLP有关(见表2)。图中成分节点随度值大小而改变,成分的度值越大,和HLP的关联就越密切,根据成分-靶点网络拓扑图和表2,槲皮素、亚油酸等可能是山楂治疗HLP的核心成分。

图2 关键靶点网络拓扑图

图3 成分-靶点网络拓扑图

表2 山楂治疗HLP的有效成分

2.5 GO生物过程和KEGG信号通路富集分析通过DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。GO分析得到667个生物学过程、76个细胞组分和166个分子功能。根据富集度(enrichment score)的数值分别选择前10个生物学过程,细胞组分和分子功能通过微生信网站绘制GO term BP、CC、MF三合一柱状图(见图4)。研究表明,富集度数值越大该GO term越易受到实验因素的影响。生物学过程包括正调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、正调控基因表达和信号转导等方面;细胞组分有质膜、细胞溶质、细胞质和细胞核等;分子功能包括蛋白结合、ATP结合和锌离子结合等方面。结合柱状图可以看出对药物的反应、正调控基因表达和蛋白磷酸化等生物学过程,膜、细胞外间隙、胞外区和胞外外泌体等细胞组分,RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性,配体激活序列特异性DNA结合、酶结合和序列特异性DNA结合等分子功能在各范围内的富集度数值较高,可能对治疗HLP产生较大影响[3]。KEGG富集分析得到201条通路,根据P值和Count值选择前20个信号通路通过微生信平台绘制气泡图(见图5)。研究表明,-log10(P值)越大,P值越小,该通路的作用越显著。结合气泡图,圆点由绿色向红色过渡,P值逐渐较小,颜色越红的圆点代表的通路表示该通路在治疗HLP中的作用可能比较明显,该通路上靶基因富集程度越高。Count值表示在该条通路上富集的基因数,Count越大该通路上富集的基因数越多[18]。富集显著的通路有脂质和动脉粥样硬化通路(lipid and atherosclerosis)、癌症通路(pathways in cancer)和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等。

图4 GO term BP、CC、MF三合一柱状图

图5 信号通路气泡图

2.6 分子对接验证将山楂的12个关键靶点与治疗HLP的6个主要活性成分进行分子对接,得到分子对接的最低结合能(见表3)。研究表明,低于-5.0 kcal·mol-1的对接亲和力分数是表明化合物与其靶基因之间存在强结合相互作用的标准,亲和力分数小于-1.2 kcal·mol-1的分子对接结果表现为良好。本文的对接结果显示,除了VEGFA与蔗糖对接结果较差,结合能小于-1.2 kcal·mol-1,其余的配体和受体对接结果良好[13]。对接结果表明山楂的主要活性成分对治疗HLP的关键靶点有一定的调控作用。通过PYMOL软件对对接结果进行处理,得到了分子对接模式图(见图6),其中蓝色部分是与氢键连接的氨基酸残基,旁边数字标注为氨基酸名称,黄色部分为氢键,旁边数字标注为氢键长度。

图6 部分分子对接模式图

表3 分子对接结果

2.7 基因在正常人体的组织分布利用Excel和Cytoscape 3.9.1软件绘制出山楂-高脂血症的交集基因在人体组织分布图(见图7～8)。以基因在组织器官中的表达量大于其平均值的一倍中位值为标准,筛选出心脏、肝脏、肺、全血、骨骼肌、前列腺、甲状腺和肾脏等可能与山楂治疗HLP相关性大的组织器官。通过柱状图可知,188个交集基因中有超过135个基因在心脏、肝脏、肺、全血、骨骼肌、前列腺和甲状腺中,说明山楂的有效成分可能通过这几个组织器官发挥作用来治疗HLP的。而肾脏上富集的基因数量较少,仅有44个,说明基因在肾脏上的表达情况不是很好。

图7 山楂-高脂血症交集基因的组织分布图

图8 山楂-高脂血症交集基因的组织分布柱状图

3 讨论与结论

本文通过网络药理学和分子对接技术分析了山楂的活性成分,探究了山楂治疗HLP的靶点蛋白和关键通路之间的联系,初步探讨了山楂治疗HLP的作用机制。本文共收集69种山楂的活性成分,35种与治疗HLP有关,其中槲皮素、亚油酸和阿里红酸等化合物度值较高,与治疗HLP相关性较大。槲皮素是一种黄酮类化合物,具有降血脂、抗氧化和抗炎等多种药理作用,可以降低主动脉和肝脏组织的脂质水平,降低肝脏中总胆固醇和甘油三酯水平,能调节血脂代谢,抑制肝脏脂肪沉积,从而对HLP起到防治作用[19]。亚油酸作为一种不饱和酸,能与胆固醇结合形成酯,通过降低体脂含量、肝脏中低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和甘油三酯的水平来治疗HLP[20]。

山楂的有效成分与HLP的188个交集靶点在心脏、肝脏、肺、全血、骨骼肌、前列腺和甲状腺等组织器官的表达情况良好,说明山楂治疗HLP可能是通过这几个组织器官发挥作用。通过PPI网络分析,筛选出12个治疗HLP的关键靶点,有白细胞介素(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶(AKT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体的编码基因(PPARG)和内皮一氧化氮合成酶(NOS3)等。有研究表明,蛋白激酶(AKT)在许多组织中均有表达,是PI3K-AKT通路中的关键靶点,AKT1是AKT的一种亚型,能够参与细胞代谢、生长、增殖、胰岛素信号传导、血管生成以及和HLP相关的多种生物学过程[19];NOS3可以参与精氨酸和脯氨酸的代谢,催化一氧化氮(NO)的生成,NO作为一种内皮舒张因子,可使血管舒张,调节血流,抑制血管平滑肌细胞增殖,抑制血小板和白细胞的黏附,参与多种疾病的病理生理过程[21]。山楂的有效成分在脂质与动脉粥样硬化形成过程中能够上调AKT1,协同PI3K(胞内磷脂酰基醇基酶)和NOS3参与细胞凋亡、细胞增殖以及血脂调节的过程,从而发挥治疗HLP的作用。研究发现,IL-6和TNF为重要的促炎因子,与HLP密切相关,它们能够促进脂肪细胞凋亡,抑制脂肪细胞分化与合成,刺激脂肪细胞脂质加速分解,导致胰岛素抵抗,促进动脉粥样硬化,增加患HLP的可能[18];PPARG是脂质代谢调控网络中一类转录因子PPARs的其中一种亚型,可以通过与特异DNA序列结合调控多种基因的转录,李涛等[21]研究发现PPARG表达的增加同时还能抑制炎症因子,在脂质的分解代谢方面尤为重要,能够促进脂肪细胞摄取脂肪酸,进而影响脂肪细胞中甘油三酯的生成。山楂的活性成分能够富集到与IL-6、TNF和PPARG等基因相关的通路上,通过增加PPARG的表达,激活相应的调控因子,促进脂质代谢,降低血脂,同时下调IL-6和TNF,抑制炎症发生,调节血脂,从而达到治疗HLP的目的,体现了山楂治疗HLP多成分、多靶点、多通路协同作用的特点,为后期治疗HLP的临床实验验证提供参考。