肝豆状核变性患者的临床表型和ATP7B基因变异分析①

李晓娜,赵雪杰,张 璐,种丽莉,石大鹏,董海波

(河南大学附属郑州颐和医院检验医学中心,河南 郑州 450047)

肝豆状核变性(wilson disease, WD)是一种常染色体隐性遗传的原发性铜代谢障碍性疾病,发病机制为ATP7B基因突变导致编码的ATP7B蛋白改变,引起血清铜蓝蛋白合成减少及排铜障碍。全球WD患病率约为0.25/10 000～4/10 000,致病基因携带率为1/150～1/90[1,2]。WD可发病于任何年龄,以儿童及青少年多见,早期临床以转氨酶升高,铜蓝蛋白降低为主就诊,临床呈现隐匿和多样性,容易造成误诊或漏诊[3]。WD的诊断需要结合临床症状、铜代谢和ATP7B基因变异的诊断评分系统。ATP7B基因的分子诊断成为早期确诊WD 的主要方法,同时为先证者亲属的筛查提供遗传学依据。本研究通过对50例WD患者及部分亲属进行ATP7B基因检测,了解WD患者的临床表现与ATP7B基因变异的特点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 依据患者知情同意及河南大学附属郑州颐和医学伦理委员会批准,所有基因诊断均取得了患者及家属的同意并签署了知情同意书。收集2018年11月至2022年4月经郑州颐和医院神经内科六(肝豆科)确诊的50例WD患者。诊断依据为2003年Roberts等提出的肝豆状核变性临床指南。研究对象确诊的50例WD患者及部分患者的父母及同胞,其中还包含一个家系的产前诊断。先证者来自河南、北京、山东、黑龙江、辽宁等北方省份,患者中男28例,女22例;汉族49例、满族1例,均否认近亲结婚。

1.1.2 临床资料收集:通过医院电子病例HIS系统收集患者临床资料,包括一般情况(性别、年龄、家族史等),临床表现,体格检查,实验室检查包括血常规、丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase,AST)、血清铜蓝蛋白、血清铜等,影像学检查包括腹部彩超和肾脏彩超、头颅MRI等。

1.1.3 分组:根据起病时临床症状,结合临床分型参照中华医学会神经病学分会帕金森病及运动障碍学组《肝豆状核变性的诊断与治疗指南》,分为肝型组、脑型组和混合型组。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取:采用乙二胺四乙酸盐(ethylenediaminetetraacetic acidm, EDTA)抗凝管抽取受试者3mL静脉血,用Biospin 全血基因组DNA提取试剂盒(购自杭州博日生物科技公司)提取DNA,TE(Tris-EDTA)缓冲液溶解,调解DNA浓度100μg·μL-1。

1.2.2 PCR扩增:采用Primer5软件设计引物扩增ATP7B基因编码蛋白的21个外显子,由北京六合华大基因科技有限公司合成,PCR反应体系含纯水8.μL,Ex Taq酶12.5μL,正向引物1uL,反向引物1μL ,DNA模板2μL,总反应体系25μL。PCR反应条件为94℃ 5 min;94℃ 30s、62℃30s、72℃40s,共35个循环,72℃ 5 min后4℃保存。

1.2.3 Sanger测序:对PCR产物进行Sanger测序(北京六合华大基因科技有限公司),用Sequencher软件将测序结果与标准序列比对,寻找基因突变点。通过检索文献及PubMed数据库( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)来确定突变的致病性。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 临床特点

50例患者包含男28例,女22例;年龄2～54(17.28±11.23)岁,其中18岁以下有38例(76%),其中9例(18%)有明确的家族史。根据临床症状分为肝型14例(28%)主要为儿童体检发现转氨酶升高,如果患者没有临床表现而仅仅有肝功能的转氨酶升高,临床分型可归类于症状前期;脑型28例(56%)主要为语言不清、行走不稳、双手不自在抖动等症状;混合型8例(16%)主要为上腹疼痛、纳差、尿黄、关节酸痛等症状。进一步实验室检查发现肝型组患者主要以血清ALT和AST升高为特点,与脑型组和混合型组比较有显著性差异(P<0.05);3组患者血清铜和血清铜蓝蛋白均存在不同程度的降低,其中肝型组和脑型组与混合型组比较铜蓝蛋白水平有显著性差异;部分患者存在血红蛋白降低,女性中无统计学差异,男性患者血红蛋白存在显著性差异,见表1。

表1 肝型、脑型和混合型肝豆状核变性患者的实验室检查结果比较

2.2 ATP7B基因Sanger测序结果

经ATP7B基因一代测序分析,50例WD患者中ATP7B基因变异结果,见图1。35例检出两处突变(3例为纯合子;32例为复合杂合子),13例检出1处杂合突变,1例检出3个杂合突变,1例检出4处杂合突变。50例WD患者共检出30种不同的ATP7B等位基因突变,包含错义突变、移码突变、无义突变和缺失/剪切位点突变等。最常见的等位基因突变为8号外显子的c.2333G>T/Arg778Leu,等位基因频率为31%,29例WD患者发生p.Arg778Leu变异且合并p.Leu770Leu变异,只发现一例c.2333G>A/Arg778Gln且无p.Leu770Leu变异,见图1。其次是13号外显子的c.2975C>T/Pro992Leu,等位基因频率为11%,见表2。WD先证者一级亲属筛查发现23例携带者,检出8种错义突变,见表3。

图1 ATP7B基因8号外显子c.2333位点和c.2310位点的Sanger测序图

表2 50例肝豆状核变性患者ATP7B基因突变的分布及等位基因频率

表3 23例ATP7B基因携带者的突变的分布及等位基因频率

3 讨论

WD致病基因位于染色体13q14.3,编码一种铜转运P型ATP酶(ATP7B蛋白),参与铜的跨膜转运,故称ATP7B基因[4]。ATP7B基因发生突变导致ATP7B蛋白功能丧失,使得铜蓝蛋白的合成减少,铜过量沉积在肝脏等组织器官,出现一系列铜中毒的临床症状[5,6]。本研究中38例患者在18岁前出现临床症状,其中12例年龄<8岁,均为体检发现转氨酶升高,进一步检查发现铜蓝蛋白降低,ATP7B基因检测发现致病位点突变。本文与Nagral等[7]研究发现WD发病多在5～35岁发病,年龄<10岁的患者多以肝脏症状首发的结果一致。血清铜蓝蛋白可作大规模WD早期筛查的指标之一。同时还发现1例50岁以上起病患者,近来多个流行病学调查还发现40岁以上起病患者[8]。肝型WD患者的转氨酶明显高于脑型WD患者,且脑型WD患者的发病年龄比肝型WD患者晚,一些早期转氨酶升高WD患者会慢慢出现脑型患者症状,这可能跟铜最先在肝脏内蓄积,继而在脑、骨、肾脏、角膜等组织蓄积相关。

ATP7B基因主要突变为错义突变、无义突变、缺失和剪切位点突变。本研究发现74%(34/50)的WD发现两处及以上突变,26%(13/50)的WD患者只检查到一处杂合突变。Ferenci[9]发现WD患者中2个突变的变异率为78.4%,一个突变的变异率为21.6%。WD的致病原因还包括ATP7B外显子缺失。有研究证实4%的患者存在ATP7B基因部分缺失[10]。对于1个致病突变的患者不排斥外显子缺失或者基因检测技术局限性为被检出可能性。50例患者中共检测出30个突变,其中比较常见的是c.2333G>T/p.Arg778Leu,c.2975C>T/p.Pro992Leu,c.2621C>T/p.Ala874Val,c.2755C>T/p.Arg919Trp,c.3316G>A/p.Val1106Ile,29子p.Arg778Leu突变患者全部合并p.Leu770Leu,p.Arg778Gln未合并p.Leu770Leu。有文献报道[11]我国WD患者高频突变为p.Arg778Leu、p.Pro992Leu、p.Thr935Met,本研究发现高频突变为p.Arg778Leu、p.Pro992Leu、p.Ala874Val,这可能跟地域差异有关。WD在肝脏方面表现为急性肝炎、急性肝衰竭、慢性肝炎、肝硬化等多种形式,容易忽略的无症状患者及危重的肝衰竭患者,儿童或者青少年WD患者的最早期表现为轻到中度脂肪肝,还有部分患者无任何明显的临床症状[12]。ATP7B先证者同胞患病概率为1/4,ATP7B基因检测可以作为一线筛查的方法[3],有9例WD患者有明确的同胞患病史,其它患者同胞检测发现23例携带者,检测出8种ATP7B突变,为WD的早期确诊提供科学依据。部分携带者存在转氨酶升高或铜蓝蛋白异常现象,临床要密切随访,定期复查与肝脏损伤和神经系统受累相关的检查,争取做到尽早治疗、个体化治疗和终生治疗。