HS-SPME-GC-MS分析‘粉蕴’含笑不同开花时期花器官挥发性成分的变化规律

郑超荣,胡莹冰,2,谭雨晴,雍玉冰,巢 瑾,张 哲,陈 燕,金晓玲*

1中南林业科技大学风景园林学院,长沙 410004;2浙江广厦建设职业技术大学建筑工程学院,东阳 322100;3湖南省茶业集团股份有限公司,长沙 410126

花香是指由植物花朵中释放出的一系列分子量低、挥发性强的芳香物质而组成的复杂混合物。适宜浓度的花香对人体身心健康有积极影响。因而,花香也被誉为“花卉的灵魂”,是植物重要的观赏性状之一[1]。花朵挥发性成分的提取方法主要有蒸馏法、有机溶剂提取法、微波辅助提取法、超临界CO2萃取法、顶空固相微萃取法(HS-SPME)和同时蒸馏萃取法等。顶空固相微萃取法由于操作简单、样品用量少、成本低、应用范围广、实验结果准确可靠等优点而被广泛采用[2]。花挥发性成分的测定方法有气相色谱-质谱联用、气相色谱-离子迁移谱、气相色谱-嗅闻和电子鼻技术等。气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)所需样品量少、灵敏度高、检测速度快,其在植物挥发性成分中广受欢迎[3]。目前,国内外大多是采用HS-SPME-GC-MS来测定植物花挥发性成分的组成。

含笑属(Michelia)植物是著名的芳香植物,其花、叶和枝条等部位均具有丰富的芳香化合物。目前,对含笑属植物提取物的大量研究已证实,其具有保鲜、抑菌、抗癌和抗氧化等功能,因而被广泛应用在食品保鲜、香料和医药等领域[4]。值得注意的是,花作为植物的繁殖器官,其挥发性成分十分丰富[5]。已有研究对含笑属的白兰[6]、含笑[7]、深山含笑[8]和黄兰[9]等树种进行了花朵挥发性成分分析。

阔瓣含笑(M.platypetala)是木兰科含笑属常绿乔木,花色纯白,花香浓郁,是湖南地区的乡土树种,也是一种优良的园林观赏植物[10,11]。对于阔瓣含笑的研究,现多集中在生理特性[12]、栽培繁育[13]和杂交育种[14]等方面,对其花香成分的解析目前未见相关文献报道。‘粉蕴’含笑(M.platypetalaFenyun)是由中南林业科技大学从阔瓣含笑中通过实生选育的方法培育的新品种(品种权号20190034),其主要特点是:花期早(1月底或2月初)、花型优美、花香浓郁,具有很高的观赏价值和开发利用潜力[15]。本研究以‘粉蕴’含笑不同开花时期(花蕾期、初开期、盛开期)下的不同花器官(花被片、雄蕊、雌蕊)为研究对象,采用HS-SPME-GC-MS技术检测其花朵挥发性成分,并通过主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA),探讨‘粉蕴’含笑不同开花时期下不同花器官的挥发性成分释放规律。本研究可为后续‘粉蕴’含笑的景观应用和挥发性成分的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料‘粉蕴’含笑(Micheliaplatypetala‘Fenyun’)栽植于湖南省林业科技示范园,位于长沙市南郊。其长势良好,无病虫害。于2023年2月20日在‘粉蕴’含笑开花期间,晴朗的上午分别从树冠东南西北四个方向随机采集3个不同开花时期的花朵,即花蕾期S1(花苞片开裂,露出上表面白色,下部淡红色的花被片)、初开期S2(花被片微展开,雄蕊无散粉)、盛开期S3(花被片展开,雄蕊大量散粉)。采摘后迅速分离花被片(T)、雄蕊(S)和雌蕊(P)(见图1)于5 mL冻存管中,随后立即放入-196 ℃液氮中冷冻,用液氮罐运送到湖南省茶业集团股份有限公司进行挥发性成分的测定。

图1 ‘粉蕴’含笑不同开花时期的3个花器官(花被片、雄蕊、雌蕊)Fig.1 Three flower organs (tepal,stamen and pistil) of M.platypetala ‘Fenyun’ at different flowering stages

1.2 实验仪器与设备

7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司);手动固相微萃取进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头(美国Supelco公司)。

1.3 样品前处理和进样处理

取3个开花时期的花被片、雄蕊和雌蕊,用液氮将其快速研磨成粉末,混匀后称取5 g放进20 mL顶空瓶中,同时加入10 μL 0.0802 mg/mL的内标4-甲基-2-戊醇,密封进样,每个样品进行三次独立的重复。

将顶空瓶置于60 ℃下平衡10 min,SPME固相微萃取头萃取前在气相色谱仪的进样口250 ℃老化30 min,再插入加热平衡后的顶空瓶进行顶空萃取40 min,提取结束后,将固相微萃取头立即插入气相色谱仪进样口,在250 ℃解析5 min。

1.4 气相色谱质谱(GC-MS)条件

色谱条件:以氦(99.999%)为载气,流速为1 mL/min,不分流进样,进样口温度250 ℃。初始温度70 ℃,持续5 min,以15 ℃/min的速度升至100 ℃,接着以5 ℃/min的速度升至125 ℃,然后以2 ℃/min的速度升至150 ℃,最后以20 ℃/min的速度升至280 ℃,并在280 ℃下保持4 min。

质谱条件:电子电离源,离子源温度为230 ℃,四极杆温度150 ℃,质谱扫描范围m/z30～500;传输线温度280 ℃。

1.5 数据分析

通过AnalysisBaseFileConverter 软件将采集的原始质谱数据转换成abf格式导入MS-DIAL4软件,选择合适的质谱图作为参比谱图,进行目标峰的提取、匹配和对齐,以NIST 20数据库的质谱信息和保留指数(retention index,RI)信息,匹配度>80为标准,对质谱峰进行定性。用内标4-甲基-2-戊醇的峰面积校正各代谢物峰面积。化合物的定量采用峰面积归一法计算,挥发性成分的含量计算公式为:挥发性成分含量(mg/kg)=(待测化合物的峰面积×内标浓度×内标体积)/(内标的峰面积×样品质量)。使用Microsoft Excel 2021对挥发性成分的种类、相对含量进行数据分析,使用GraphPad Prism 8绘图,使用SIMCA 14.1进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。

2 实验结果

2.1 ‘粉蕴’含笑不同开花时期花器官挥发性成分的鉴定和相对含量分析

对‘粉蕴’含笑花挥发性成分进行GC-MS分析,将其总离子流图(见图2)与质谱数据进行比对,并查阅相关文献,最终鉴定出93种挥发性成分,包括萜烯类化合物43种(单萜类25种,倍半萜烯类18种)、烷烃类化合物11种、酯类化合物9种、醛类和醇类化合物各8种、烯烃类和酮类化合物各4种、醚类和芳香族化合物各2种、酚类和杂环类各1种(见表1)。其中,萜烯类数量最多,烷烃类和酯类次之。可见,‘粉蕴’含笑花朵挥发性成分组成丰富,萜烯类和烷烃类是其最主要的种类构成。

表1 ‘粉蕴’含笑不同开花时期花器官挥发性成分种类及相对含量

图2 ‘粉蕴’含笑不同开花时期花器官挥发性成分的总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of volatile constituents in flowering organs of M.platypetala ‘Fenyun’ at different flowering stages

2.1.1 花被片的挥发性成分种类和相对含量

在3个不同开花时期的花被片中共鉴定出72种挥发性物质,其中花蕾期66种、初开期67种、盛开期71种,主要成分是烷烃类,有7种,在3个开花时期的相对含量分别为66.91%、68.91%、62.59%(见表1)。由图3可知,花被片中相对含量大于2%的挥发性成分有8种,按相对含量大小排序依次为2,6,10-三甲基十四烷、异十六(碳)烷、β-异可烯、γ-杜松烯、1,2-二甲氧基苯、3,9-愈创木二烯、δ-榄香烯和2-甲氧基苯酚。其中,烷烃类化合物2,6,10-三甲基十四烷和异十六(碳)烷均在初开期达到最大值,相对含量分别为33.34%和33.13%。萜烯类化合物γ-杜松烯、β-异可烯、3,9-愈创木二烯和δ-榄香烯在盛开期相对含量最高。乙酸桃金娘烯酯是花被片中的特异性成分。

图3 ‘粉蕴’含笑不同开花时期花器官中挥发性成分的相对含量(>2%)Fig.3 Relative content of volatile components (>2%) in the floral organs of M.platypetala‘Fenyun’at different flowering stages

2.1.2 雄蕊的挥发性成分种类和相对含量

在3个不同开花时期的雄蕊中共鉴定出86种挥发性物质,其中花蕾期82种、初开期83种、盛开期80种,主要成分为萜烯类化合物,有42种,在3个开花时期的相对含量分别为68.81%、56.44%、59.60%(见表1)。由图3可知,雄蕊中相对含量大于2%的挥发性成分有10种,按相对含量大小排序依次为2,6,10-三甲基十四烷、异十六(碳)烷、γ-杜松烯、β-异可烯、3,9-愈创木二烯、δ-榄香烯、1,2-二甲氧基苯、(+)-香橙烯、β-蒎烯和α-雪松烯。萜烯类化合物在花蕾期相对含量达到最大值,烷烃类化合物相对含量在初开期均高于花蕾期和盛开期。与花被片进行对比,雄蕊中烷烃类化合物相对含量有所下降,萜烯类化合物相对含量上升。此外,伞形花酮、木薄荷衍生物和反-2-辛醛是雄蕊中的特异性成分。

2.1.3 雌蕊的挥发性成分种类和相对含量

在3个不同开花时期雌蕊中共鉴定出86种挥发性物质,其中花蕾期78种、初开期77种、盛开期81种。花蕾期和盛开期雌蕊中萜烯类化合物相对含量最高,相对含量分别为57.59%、62.82%。初开期雌蕊中烷烃类化合物相对含量最高,相对含量为54.52%(见表1)。由图3可知,雌蕊中相对含量大于2%的挥发性成分有11种,按相对含量大小排序依次为2,6,10-三甲基十四烷、异十六(碳)烷、γ-杜松烯、1,2-二甲氧基苯、3,9-愈创木二烯、δ-榄香烯、(+)-香橙烯、α-雪松烯、β-异可烯、β-蒎烯和龙脑乙酸酯。2,6,10-三甲基十四烷和异十六(碳)烷在初开期相对含量达到最大值,占比为26.20%和25.90%。雌蕊中相对含量大于2%的化合物均比花被片和雄蕊中多。γ-杜松烯在萜烯类化合物中相对含量最高,在3个不同开花时期占比分别为18.38%、10.04%和18.68%。别罗勒烯、十二烷、甲酸法呢酯、己醇和3,4-二氢-2H-吡喃是雌蕊中的特异性成分。

2.2 挥发性成分的释放量分析

由图4可知,花被片中的挥发性成分含量最高,雄蕊次之,雌蕊最低。随着花朵的开放,3个开花时期的花被片挥发性成分含量呈显著下降趋势,雄蕊在3个开花时期没有显著差异,而雌蕊的挥发性成分含量在花蕾期显著高于初开期和盛开期,但初开期和盛开期没有显著差异。由此,‘粉蕴’含笑在花蕾期挥发性成分释放量最高,3种花器官中花被片的挥发性成分含量最高。

图4 ‘粉蕴’含笑不同开花时期花器官中挥发性成分的释放量Fig.4 Volatile component release from organs of M.platypetala ‘Fenyun’ at different flowering stages

2.3 挥发性成分的PCA和PLS-DA分析

为进一步分析‘粉蕴’含笑不同开花时期花器官挥发性成分的差异,本研究采用PCA对‘粉蕴’含笑各样品挥发性成分的相对含量进行分析。结果表明,主成分1和主成分2的方差贡献率分别为57.40%和21.40%,说明这两个主成分包含了所有样品中的大部分信息。花蕾期、初开期、盛开期花被片与主成分1呈正相关,花蕾期、初开期、盛开期雄蕊与主成分1呈负相关,花蕾期、初开期、盛开期雌蕊与主成分2呈正相关,表明3种花器官(T、S、P)之间区分良好,不同花器官的挥发性成分有较大差异;同种花器官3个开花时期(S1、S2、S3)的样品较为靠近,表明同种花器官不同时期的挥发性成分差异较小(见图5A)。

图5 ‘粉蕴’含笑3种花器官的PCA与PLS-DA分析Fig.5 PCA and PLS-DA analysis of three flower organs of M.platypetala ‘Fenyun’

从PCA的载荷图(见图5B)可知,2,6,10-三甲基十四烷、异十六(碳)烷、十三烷、十七烷、水杨酸甲酯、十七烯、十六碳烯和2-甲氧基苯酚等与主成分1有较大的正相关。δ-榄香烯、α-雪松烯、3,9-愈创木二烯、古巴烯、月桂烯、γ-杜松烯和2-羟基醋酸樟香醇等与主成分1有较大的负相关。柠檬醛、香茅醇、龙脑乙酸酯、莰烯、桉油精、(+)-表双环倍半水芹烯和(+)-香橙烯等与主成分2有较大的正相关。由此可知,2,6,10-三甲基十四烷、异十六(碳)烷、十三烷、香茅醇、龙脑乙酸酯和莰烯是导致花被片和雌蕊差异较大的物质,δ-榄香烯、α-雪松烯、3,9-愈创木二烯和γ-杜松烯是导致雄蕊有别于花被片和雌蕊的化合物。

为进一步得出不同开花时期花器官中的差异挥发性化合物,采用PLS-DA对挥发性成分进行判别分析,计算变量投影重要度(variable importance in projection,VIP)可以衡量挥发性成分对各样品的影响强度。从PLS-DA模型VIP得分图(见图5C)可知,共有12种挥发性成分可以作为区分3种花器官的差异性物质(VIP>1),包括β-异可烯、γ-杜松烯、2,6,10-三甲基十四烷、异十六(碳)烷、1,2-二甲氧基苯、(+)-香橙烯、3,9-愈创木二烯、龙脑乙酸酯、芳樟醇、β-蒎烯、δ-榄香烯和2-甲氧基苯酚。其中2,6,10-三甲基十四烷、6-甲基十五烷和2-甲氧基苯酚在3个开花时期的花被片中的相对含量较高,β-异可烯、3,9-愈创木二烯、芳樟醇、β-蒎烯和δ-榄香烯在3个开花时期的雄蕊中相对含量较高,γ-杜松烯、1,2-二甲氧基苯、(+)-香橙烯和龙脑乙酸酯在3个开花时期的雌蕊中相对含量较高。

3 讨论与结论

花香是一种重要的次生代谢物,它由各种低分子量的化合物组成,含有特定的化学信息[16]。花器官特化的腺状表皮细胞或基本薄壁组织细胞通常是产生植物香味的地方[17]。在含笑属植物中,亮叶含笑花被片的主要成分为异长叶烯-5-酮[18],紫花含笑花被片中的主要成分为α-愈创木烯[19],含笑花被片中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的相对含量高达83.26%[7]。‘粉蕴’含笑花被片中的主要成分为2.6,10-三甲基十四烷、异十六(碳)烷。可见在同属植物相同花器官之间,花被片挥发性物质的主要成分也有很大差异。挥发性成分的合成与释放可能受植物基因型和环境条件的共同影响。在未来的研究中,可基于这两种挥发性成分开发利用‘粉蕴’含笑花被片。

γ-杜松烯、3,9-愈创木二烯、δ-榄香烯和(+)-香橙烯是‘粉蕴’含笑雄蕊和雌蕊中萜烯类化合物的主要挥发性成分。其中γ-杜松烯可用于调制柑橘、芒果等食用香精[20]。研究表明萜类物质是植物释放最多的一类化合物,有良好的杀菌消毒、降低人体血压、使人镇静放松的作用[21]。此外,‘粉蕴’含笑鉴定出的93种挥发性成分中,萜烯类物质的种类最为丰富有43种,与前人研究结果一致,盛花期西藏虎头兰花朵中共鉴定出89种挥发性成分,萜烯类化合物种类最多有26种[22]。紫玉兰鲜花检测出的43种成分中,有22种是萜烯类化合物[8]。作为优良的芳香植物,‘粉蕴’含笑可广泛应用在康复花园等健康景观中,从而为人体的身心健康提供帮助。

目前关于不同花期的花器官挥发性成分含量变化特点的研究报道较少,不同花器官的挥发性成分含量与花期显著相关。紫花含笑的花挥发性成分释放量在盛开期最高,在不同开花时期中雌蕊的挥发性成分含量最高[3,23]‘白兰地’海棠在4个开花时期中,雌蕊的挥发性成分总释放量最高,花瓣最低,挥发性成分的总释放量在盛开期达到最高[24]。岳麓连蕊茶与单体红山茶花挥发性成分含量在盛开期达到顶峰,且雄蕊是不同花期释放香气的主要花器官[25]。本研究表明,‘粉蕴’含笑的花挥发性成分释放量在花蕾期最高,不同开花时期中花被片的挥发性成分含量最高,其次是雄蕊,雌蕊最低。因此不同的植物花香释放有不同的规律,可能与吸引不同的传粉昆虫有关[26]。‘粉蕴’含笑在3个不同开花时期中,3种花器官的挥发性成分的相对含量并未呈现出规律性的变化。如花被片和雌蕊中醇类化合物在盛开期达到最大值,雄蕊中其在花蕾期达到最大值。花器官不同开花时期的花挥发性成分的变化,可能受光照、温度和激素的共同影响[27]。

本研究采用顶空固相微萃取与气质联用技术(HS-SPME-GC-MS)从‘粉蕴’含笑不同开花时期的不同花器官中共鉴定出93种挥发性物质。2,6,10-三甲基十四烷、异十六(碳)烷、γ-杜松烯和β-异可烯是‘粉蕴’含笑开花过程中的主要挥发性成分,不同花器官的挥发性成分存在差异,花被片是其挥发性成分释放的主要花器官。本研究为进一步开发利用‘粉蕴’含笑中的挥发性成分提供了数据支持。