不同产地肉桂质量及炮制过程成分变化研究

梅 菊,吴 涛,李 强,刘 洋,殷 涛,廖香莲,2,孙代华,胡力飞,3*

1湖北省中药配方颗粒工程技术研究中心,黄石 435100;2湖北师范大学生命科学学院,黄石 435002;3湖北工业大学教育部工业发酵省部共建协同创新中心,武汉 430068

肉桂为樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥树皮,多于春、秋季剥取,阴干,始载于《神农本草经》,为我国应用非常广泛的药食同源药材,有“补火助阳,引火归元,散寒止痛,温通经脉”的功效[1]。现代药理学研究表明,肉桂具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、减轻胃损伤、改善学习记忆能力等多种药理作用[2-12];肉桂中含有挥发油、黄酮、倍半萜、多糖等多种成分,其中挥发性成分为其主要功效成分[13];作为有祛寒作用的传统中药,肉桂还可激活棕色脂肪组织,通过上调产热蛋白的表达显著增加非寒颤产热[14,15]。

肉桂的炮制方法为除去杂质及粗皮。《雷公炮炙论》《本草经集注》《太平圣惠方》明确了去粗皮、去削上虚软甲错、去皱皮等制法,《太平惠民和剂局方》则称“去皮,不见火”,称肉桂去皮与否视功效而定[16]。肉桂去粗皮前后的功效往往与其中的化学成分相关,本文主要以广东阳春、云浮、肇庆及广西防城港、贵港的肉桂为研究对象,通过多指标成分评价肉桂原料产地,并对不同产地肉桂炮制过程中的成分变化进行分析,可为肉桂产地选择、质量评价等研究工作提供参考。

1 材料与试剂

1.1 实验材料

本次研究所用28批不同产地肉桂药材由劲牌持正堂药业有限公司高级工程师殷涛于2022年11月采集,具体采集产地信息见表1,样本经湖北师范大学张新潮副教授鉴定均为樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥树皮。

表1 肉桂样品产地信息

1.2 实验试剂

乙腈(色谱级,美国Fisher chemical公司);香豆素(批号:240034-202111,含量98.00%,上海鸿永生物科技有限公司);肉桂醇(批号:180011-202207,含量99.67%,上海鸿永生物科技有限公司);肉桂酸(批号:110786-201604,含量98.80%,中国食品药品检定研究院);桂皮醛(批号:110710-202223,含量98.80%,中国食品药品检定研究院);2-甲氧基桂皮醛(批号:AF21060951,含量99.84%,成都埃法生物科技有限公司);水为超纯水;其余试剂为分析纯。

1.3 仪器与设备

Agilent 1290超高效液相色谱仪(美国安捷伦有限公司);Agilent ZORBAX SB-Aq RRHT液相色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)(美国安捷伦有限公司);XS-105DU电子分析天平(梅特勒托利多科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-Aq RRHT(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脱(0～4 min,15%→22%A;4～6 min,22%A;6～12 min,22%→55%A);检测波长为265 nm;进样量2 μL;流速为0.4 mL/min;柱温30 ℃。

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 供试品溶液制备

取肉桂药材粉末(过3号筛)约 0.10 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,称定重量,超声处理(功率350 W,频率35 kHz)30 min,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.1.2.2 对照品溶液制备

精密称取香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛对照品10.98、11.61、10.30、49.01、11.10 mg至10、10、10、50、10 mL容量瓶中,加甲醇配成香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛浓度分别为1.076、1.157、1.018、0.969 4、1.108 mg/mL的对照品储备液;分别精密吸取5个对照品储备液1、1、1、10、4 mL置20 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品工作液。

2.1.3 专属性试验及共有峰的指认

精密吸取供试品(S1)、对照品、空白溶液(70%甲醇溶液)适量,在“2.1.1”项下色谱条件进样测定,结果如图1。由此可知,各成分色谱峰分离度均大于1.5,空白无干扰,表明该方法专属性良好。与对照品保留时间比对,确认峰6～10分别为香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛。

图1 对照品及肉桂样品UPLC色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of reference substances and Cinnamomi Cortex sample

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度试验

取肉桂供试品(S1)粉末,按“2.1.2.1”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件测定6次,以峰9(桂皮醛)为参照峰S,结果显示各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值分别为0.02%～0.95%和0.11%～1.0%,均小于2.0%,表明仪器精密度良好。

2.1.4.2 重复性试验

取同一批肉桂供试品(S1)粉末,按“2.1.2.1”项下方法制备成6份供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件测定,以峰9(桂皮醛)为参照峰S,结果显示各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值分别为0.02%～1.0%和0.15%～1.1%,均小于2.0%,表明该方法重复性良好。

2.1.4.3 稳定性试验

取“2.1.4.2”项下供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件分别在 0、2、4、6、8、10、24 h测定,以峰9(桂皮醛)为参照峰S,结果显示各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值分别为0.03%～0.29%和0.17%～1.2%,均小于3.0%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.5 相似度评价

取28批肉桂样品按上述方法测定并记录色谱图,将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”,采用中位数法及多点校正后进行色谱峰匹配,共标定了10个共有峰,分别生成肉桂样品的叠加图谱和对照指纹图谱(见图2)。与对照品比对指认了其中5个色谱峰,分别为香豆素(6号峰)、肉桂醇(7号峰)、肉桂酸(8号峰)、桂皮醛(9号峰)、2-甲氧基桂皮醛(10号峰)。计算28批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度,相似度均在0.996及以上(见图3),表明各批样品有较好的一致性,所建立的指纹图谱可用于评价肉桂的质量。

图2 28批肉桂UPLC指纹图谱Fig.2 UPLC fingerprints of 28 batches of Cinnamomi Cortex

图3 28批肉桂UPLC指纹图谱相似度评价结果Fig.3 UPLC fingerprint similarity evaluation results 28 batches of Cinnamomi Cortex

2.2 化学计量学研究

2.2.1 聚类分析(CA)

以共有峰面积为变量,采用OriginPro 2023软件将28批肉桂的共有峰面积进行聚类分析,以ward聚类方法结合Euclidean距离计算对28批肉桂样品进行聚类分析,以ward聚类方法结合Pearson相关性对10个共有峰进行聚类分析,聚类分析结果见图4。结果表明,样品可被分为3类,大部分防城港样本(S19～S22、S24)及肇庆市高要区样本(S14、S16～S18)及其他少量样本聚为一类,大部分广西贵港样本(S26～S28)和部分广东云浮(S5、S7、S8)、广东肇庆样本(S10、S11)聚为一类,广东阳春样本(S1～S3)与其他样本(S12、S23、S25)聚为一类,其中广东阳春、肇庆市高要区及广西防城港、贵港样品分类较为集中,而广东云浮市和肇庆市德庆县样品分类相对分散。10个峰可被分为4个组别,香豆素和2-甲氧基桂皮醛聚为一组,肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛聚为一组,峰2～5聚为一组,峰1为一组;从聚类热图中可见,原料分类与聚为一类的色谱峰有一定相关性,表明不同产地肉桂原料存在一定成分差异,可通过所含化学成分进行区分。

图4 28批肉桂聚类分析评价结果Fig.4 Evaluation results of cluster analysis of 28 batches of Cinnamomi Cortex

2.2.2 主成分分析(PCA)

采用Origin Pro 2023软件对10个共有峰面积进行主成分分析,计算相关矩阵的特征值、特征向量和分值。确定了特征值>1的4个主成分,4个主成分的累计方差贡献率为87.15%,并以PC1、PC2、PC3绘制28批次肉桂样本的双标图(见图5)。第一主成分(PC1)解释了总方差的39.19%,信息主要来自于峰2～5及香豆素,与这几个成分均呈正相关;第二个主成分(PC2)解释了总方差的24.21%,信息主要来自于肉桂醇、肉桂酸和肉桂醛,并均呈正相关;第三个主成分(PC3)解释了总方差的12.72%,信息主要来自于峰1、香豆素和2-甲氧基桂皮醛,与峰1呈正相关,与香豆素和2-甲氧基桂皮醛呈负相关;第四个主成分(PC4)解释了总方差的11.03%,信息主要来自于峰1且呈正相关。广西防城港、贵港、广东阳春及部分肇庆样本分布较为集中,云浮及部分肇庆样本分布相对分散,但分布仍有一定规律,可能受其他相近的样本的影响了其分类,而各变量主成分载荷情况则与“2.2.1”中色谱峰的聚类分析结果相似;肉桂样本主成分分析情况与聚类分析结果相近。

图5 PCA双标图Fig.5 PCA biplot

2.2.3 正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)

采用SIMCA14.1软件对样本及10个共有峰变量进行OPLS-DA分析,结果表明,通过OPLS-DA,各市县分类模型拟合效果不佳,但可实现对广东、广西两省肉桂的有效区分。分析中的自变量拟合指数(R2X)为0.864,因变量拟合指数(R2Y)为0.833,模型预测指数(Q2)为0.629,R2和Q2均超过了0.5,表明该模型拟合结果可接受;同时通过200次置换检测,Q2回归线与纵轴的相交点小于0,说明模型不存在过拟合,所建立的模型有效,认为该结果可用于肉桂产地对比分析,相关分析结果如图6、图7所示。结果表明,OPLS-DA将肉桂样本分为两类,所生成的变量VIP图8所示,并以VIP大于1为阈值,筛选出5个贡献值较大的成分,依次为香豆素、峰3、峰5、2-甲氧基桂皮醛和峰2,判断其为区分广东、广西样本的代表性差异成分;成分差异可能与两省药材种植环境的不同相关。

图6 OPLS-DA得分图Fig.6 OPLS-DA scrore plot

图7 OPLS-DA模型置换验证图Fig.7 OPLS-DA model permutation test diagram

图8 OPLS-DA模型VIP值Fig.8 VIP value of OPLS-DA model

2.3 药材含量测定

结合上述分析及峰面积情况,确定对肉桂中香豆素、2-甲氧基桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛5个成分进行含量测定。

2.3.1 线性关系考察

将“2.1.2.2”项下混合对照品工作液分别稀释2、5、10、50、200、1 000倍后各进样2 μL,进样测定,记录5个成分峰面积,以峰面积为纵坐标,对照品浓度(mg/mL)为横坐标,绘制曲线方程,得到5个成分的回归方程及线性范围,结果见表2。

表2 各成分线性关系

2.3.2 精密度试验

取肉桂供试品(S1)粉末,按“2.1.2.1”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件测定6次,记录香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛的峰面积,并计算峰面积RSD值分别为0.60%、1.4%、0.51%、1.8%和0.40%,表明该仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验

取同一肉桂供试品(S1)粉末6份,按“2.1.2.1”项下方法制备成6份供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进行测定,记录5个成分的峰面积,测定含量并计算RSD值,5种成分的平均质量分数分别为0.81、0.04、0.29、26.26、4.93 mg/g,RSD分别为0.33%、3.6%、0.46%、1.3%、0.59%,表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验

取肉桂供试品(S1)粉末,按“2.1.2.1”项下方法制备成供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定,记录5个成分的峰面积并计算RSD值,结果显示5个成分RSD值分别为0.59%、1.1%、0.52%、0.19%、0.20%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验

称取同一肉桂供试品粉末(S1)0.05 g共6份,精密称定,分别加入含香豆素0.053 8 mg/mL、肉桂醇0.002 3 mg/mL、肉桂酸0.030 6 mg/mL、桂皮醛1.454 1 mg/mL、2-甲氧基桂皮醛0.277 1 mg/mL的混合对照品溶液1 mL,按“2.1.2.1”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进行测定,计算5个成分的加样回收率及RSD值,结果见表3。结果表明5个成分的平均回收率为97.65%～103.4%,其RSD均在1.2%～2.5%之间,可以满足5个成分的含量测定要求。

表3 加样回收率试验结果

2.3.6 药材及饮片含量测定

取肉桂药材样品按《中华人民共和国药典》(2020年版)第一部肉桂项下要求除去粗皮,28批饮片的得率范围为91.85%～97.39%之间(每批约150 0 g),将炮制前后的药材及饮片分别按“2.1.2.1”项下方法制备成供试品溶液,每批样品平行两份,按“2.1.1”项下色谱条件进行含量测定,采用外标一点法计算香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛和2-甲氧基桂皮醛的含量。同时,取约20 g通过2号筛至3号筛的肉桂粉末,每批样品平行两份,采用《中华人民共和国药典》(2020年版)挥发油测定法项下乙法测定其挥发油量,计算肉桂中挥发油含量。

5个成分及挥发油含量测定结果及对比情况见表4及图9。其中各批次药材和饮片中5个成分及挥发油含量虽略有差异,但各指标含量均值较为相近。其中5个成分的含量平均值由高到低均为桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛、香豆素、肉桂酸和肉桂醇;同时各批次间桂皮醛、肉桂酸和肉桂醇的整体变化趋势相近,2-甲氧基桂皮醛和香豆素的变化趋势相近,与前期共有峰分类结果一致。

图9 肉桂药材和饮片多指标成分含量对比图Fig.9 Comparison of multi-index components content of Cinnamomi Cortex medicinal materials and decoction pieces

表4 肉桂样本炮制前后含量测定结果

3 讨论与结论

本研究采集了广东、广西共7个县/市28批肉桂样品,采用UPLC法建立了肉桂样品的指纹图谱,各批次肉桂样品与对照图谱的相似度在0.996及以上,相似度良好,所建立的指纹图谱可用于评价肉桂的质量。采用Origin Pro 2023软件以10个共有峰面积为变量对28批肉桂进行聚类分析和主成分分析,聚类分析表明样本可分为3类,其中广东阳春、肇庆市高要区及广西防城港、贵港样本分类较为集中,而广东云浮市和肇庆市德庆县样本分类相对分散,10个共有峰被分为4类,香豆素和2-甲氧基桂皮醛聚为一类,肉桂醇、肉桂酸和桂皮醛聚为一类,峰2～5聚为一类,峰1为一类,原料分类与峰的分类有一定相关性,不同产地肉桂原料存在一定差异,可通过所含化学成分进行区分;主成分分析确定了4个主成分,第一主成分的信息主要来自于峰2～5,第二个主成分的信息主要来自于肉桂醇、肉桂酸和肉桂醛,第三个主成分的信息主要来自于香豆素和2-甲氧基桂皮醛,第四个主成分的信息来(PC4)主要自于峰1,得分图显示其中广西防城港、贵港、广东阳春及部分肇庆样本分布较为集中,云浮及部分肇庆样本分布相对分散,但各产地分布仍有一定规律,各主成分的信息来源及得分图结果与聚类分析结果相似。同时,采用SIMCA14.1软件对10个共有峰变量进行了OPLS-DA分析,可实现对广东、广西两省肉桂的有效区分,筛选出5个对产地区分贡献值较大的成分(香豆素、峰3、峰5、2-甲氧基桂皮醛和峰2),成分的差异可能与产地的种植环境不同相关。并结合峰面积情况确定对肉桂中的香豆素、2-甲氧基桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛5个成分进行了UPLC含量测定。

含量及挥发油测定结果表明,肉桂炮制前后5个成分及挥发油含量均值较为相似,肉桂“去皮,不见火”的原因与桂皮醛等酚类成分及挥发油的相关性较低;且各批次间桂皮醛、肉桂酸和肉桂醇的整体变化趋势相近,2-甲氧基桂皮醛和香豆素的变化趋势相近,与前期共有峰分类结果一致。

综上所述,本研究建立了肉桂UPLC指纹图谱方法,采用化学计量方法对各产地药材及共有峰进行了分析,建立了5个成分的含量测定方法,并对药材炮制前后的成分差异进行了对比研究,以期为肉桂药材的产地选择、质量研究提供参考。