芩莲正积方水提物中总黄酮提取工艺的优化*

孙 瑶，苏 适，陈洪玉，张晓萌，阎力君

（哈尔滨商业大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150076）

芩莲正积方由黄芩、半枝莲、清半夏、莪术、重楼、浙贝母、薏苡仁、厚朴、陈皮和甘草10 味中药组成，具有扶正祛邪的功效，能抑制肺癌转移，在临床上对非小细胞肺癌患者有良好的治疗作用[1-4]。研究表明，芩莲正积方中的有效成分黄酮类化合物能发挥重要的抗肿瘤作用，能阻滞NSCLC 细胞增殖，抑制EMT 和血管生成，抑制NSCLC 的生长和转移，促进NSCLC 细胞凋亡等[5-7]。中药材的溶剂提取法在多种提取方法中应用广泛，根据相似相溶原理，溶剂进入药材内部，通过解除组织吸附作用而提高有效成分的浓度，增加渗透压，形成细胞内外渗透压差，破坏植物细胞壁而加快内容物流出，能够有效提取化合物[8]。黄酮类化合物的提取方法广泛，包括水提法、回流-酶法和超声-酶法、超声波提取和微波提取等[9-11]。水提法是传统的中药提取方法，具有操作简单、提取方便和成本低等优点，能够有效地提取黄酮类化合物[12]。因此，本实验采用水提法提取芩莲正积方，以方中总黄酮提取率为指标，经由单因素实验和正交实验优化提取工艺，为芩莲正积方更好的发挥疗效奠定基础。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

黄芩、半枝莲、清半夏、莪术、重楼、浙贝母、厚朴、薏苡仁、陈皮和甘草，均购自黑龙江省哈尔滨市三棵树药材市场。

NaNO2（AR 纯度99% 天津市天力化学试剂有限公司）；Al（NO3）3（AR 纯度99% 天津市福晨化学试剂厂）；NaOH（AR 纯度96% 天津市天力化学试剂有限公司）；无水乙醇（纯度100% 中国科学院成都生物研究所）；蒸馏水（哈尔滨市南岗区实林蒸馏水经销处）。

精密电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；XMTD-4000 型电热恒温水浴锅（海申盛生物技术有限公司）；SE-750 型高速多功能粉碎机（永康市圣象电器有限公司）；Re-52AA 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水式多功能真空泵（巩义市瑞德仪器设备有限公司）；L550 型台式低速大容量离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；T6 新世纪型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 取适量黄芩、半枝莲、清半夏、莪术、重楼、浙贝母、厚朴、薏苡仁、陈皮、甘草于高速多功能粉碎机进行粉碎，过筛后收集到自封袋中备用。

1.2.2 溶液的制备

5%NaNO2溶液 称取NaNO210.00g，用蒸馏水溶解后定容至200mL。

10%Al（NO3）3溶液 称取Al（NO3）320.00g，用蒸馏水溶解后定容至200mL。

4%NaOH 溶液 称取NaOH 8.00g，用蒸馏水溶解后定容至200mL。

60%乙醇溶液 量取无水乙醇600mL，用蒸馏水定容至1000mL。

芦丁标准品溶液（0.1mg·mL-1）称取芦丁10.00mg，加无水乙醇溶解，然后用60%的乙醇溶液定容至100mL，摇匀。

供试品溶液（1mg·mL-1）称取芩莲正积方水提物粉末5.00mg，用蒸馏水定容至5mL，摇匀。

1.2.3 标准曲线的绘制 量取芦丁标准品溶液（0.1mg·mL-1）5 份，体积分别为0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，转移至10mL 容量瓶中，分别加入蒸馏水5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5mL，混合均匀后加入0.3mL的5%NaNO2溶液，静置5min，然后加入0.3mL 的10%Al（NO3）3溶液，静置6min，再加入2mL 的4%NaOH 溶液，蒸馏水定容至刻度线，混匀后静置10min，以第一组为空白，于510nm 处测定吸光度，绘制标准曲线，以芦丁的浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为：Y=11.189X-0.0012，R2=0.9993，方程的线性良好。

1.2.4 芩莲正积方总黄酮提取率测定 精密称取芩莲正积方提取物粉末，按“1.2.2”项下步骤配制成0.2mg·mL-1的供试品溶液，按“1.2.3”项下步骤测定芩莲正积方提取物供试品溶液的吸光度，得到芩莲正积方提取物的总黄酮提取率。

表1 单因素实验表Tab.1 Single factor experiment

1.2.5 单因素实验

（1）浸泡时间的影响 将13.5g 芩莲正积方总药物粉末按照料液比1∶15 加入蒸馏水202.5mL，混合均匀，室温下分别不浸泡、浸泡0.5、1、1.5、2h 后，置于80℃的水浴锅中提取60min（提取1 次）。将提取的滤液在4000r·min-1条件下离心10min，上清液经布氏漏斗抽滤，旋转蒸发仪浓缩药液后，转移至蒸发皿烘干，收集粉末备用。

（2）提取温度的影响 将13.5g 芩莲正积方总药物粉末按照料液比1∶15 加入蒸馏水202.5mL，混合均匀，室温下浸泡0.5h 后，分别置于60、70、80、90、100℃的水浴锅中提取60min（提取1 次）。将提取的滤液在4000r·min-1下离心10min，上清液经布氏漏斗抽滤，旋转蒸发仪浓缩药液后，转移至蒸发皿烘干，收集粉末备用。

（3）提取次数的影响 将13.5g 芩莲正积方总药物粉末按照料液比1∶15 加入蒸馏水202.5mL，混合均匀，室温下浸泡0.5h 后，置于80℃的水浴锅中提取60min，分别提取1、2、3、4、5 次。将提取的滤液在4000r·min-1下离心10min，上清液经布氏漏斗抽滤，旋转蒸发仪浓缩药液后，转移至蒸发皿烘干，收集粉末备用。

（4）提取时间的影响 将13.5g 芩莲正积方总药物粉末按照料液比1∶15 加入蒸馏水202.5mL，混合均匀，室温下浸泡0.5h 后，置于80℃的水浴锅中分别提取30、60、90、120、150min（提取1 次）。将提取的滤液在4000r·min-1下离心10min，上清液经布氏漏斗抽滤，旋转蒸发仪浓缩药液后，转移至蒸发皿烘干，收集粉末备用。

（5）料液比的影响 将13.5g 芩莲正积方总药物粉末分别按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入蒸馏水，混合均匀，室温下浸泡0.5h 后，置于80℃的水浴锅中提取60min（提取1 次）。将提取的滤液在4000r·min-1下离心10min，上清液经布氏漏斗抽滤，旋转蒸发仪浓缩药液后，转移至蒸发皿烘干，收集粉末备用。

1.2.6 正交实验 根据单因素实验结果，以芩莲正积方中总黄酮提取率为指标，筛选出3 个对总黄酮提取率影响较大的因素，设计三因素三水平的L9（33）正交实验，正交实验因素水平表见表2，正交实验设计表见表3。

表2 正交实验因素水平表Tab.2 Orthogonal experiment level factor table

表3 正交实验设计表Tab.3 Orthogonal experiment design table

1.2.7 数据统计与分析 使用Graphpad Prism8.0软件进行图表制作，使用SPSS 25.0 软件进行数据分析，数据以X±S 表示，两组均数比较用T 检验，多组均数比较用单因素方差分析，P＜0.05 显示有差异，具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 浸泡时间的影响（图1）

图1 不同浸泡时间对黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of different soaking time on the extraction rate of flavonoids

由图1 可见，延长药材浸泡时间，并不能使芩莲正积方中总黄酮提取率增加，反而呈现降低的趋势，浸泡时间为0h 时，黄酮提取率最高，考虑到节约时间和成本的因素，为简化提取工艺，故选择无需浸泡进行后续实验。

2.1.2 提取温度的影响（图2）

图2 不同提取温度对黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of different extraction temperatures on the extraction rate of flavonoids

由图2 可见，随着温度的升高，能够加快分子间的热运动，有利于药材细胞壁的破裂和溶剂渗入药材而提高总黄酮的得率，在70～90℃范围内黄酮提取率较高，提取温度为80℃时，提取率最高，故选择70、80、90℃进行正交实验。

2.1.3 提取次数的影响（图3）

图3 不同提取次数对黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of different extraction times on the extraction rate of flavonoids

由图3 可见，增加提取次数，并不能显著改善芩莲正积方提取物中总黄酮提取率，由于此方中的药材较多，提取出的有效成分也较多，方中半枝莲、清半夏、浙贝母、厚朴、陈皮都含有生物碱成分，而黄酮类化合物多具酚羟基，显酸性，可与碱类成分发生反应；有研究表明[13]，提取2 次时，生物碱提取率最高，故推测提取次数为2 次时，大部分黄酮与生物碱发生了反应；提取3～5 次时，黄酮提取率根据药液中生物碱的量的减少有所回升。提取1 次得到的黄酮提取率最高，故选择提取次数为1 次进行后续实验。

2.1.4 提取时间的影响（图4）

由图4 可见，提取时间在30～60min 和90～120min两个范围内，芩莲正积方提取物中总黄酮提取率和提取时间成正比。提取时间在60～90min 和120～150min 两个范围，芩莲正积方提取物中总黄酮提取率和提取时间成反比。说明改变提取时间可以影响芩莲正积方提取物中总黄酮提取率，30～90min 比90～150min 黄酮提取率高，所以将提取时间作为正交实验的一个考察因素，设置3 个水平为30、60、90min。

2.1.5 料液比的影响（图5）

图5 不同料液比对黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of different ratio of material-liquid on extraction rate of flavonoids

由图5 可见，当料液比为1∶15 时，黄酮提取率最高，料液比在1∶15～1∶30 范围内，芩莲正积方提取物中总黄酮提取率和料液比成反比。可见料液比影响芩莲正积方提取物中总黄酮提取率，因此，将料液比作为正交实验的一个考察因素，设置3 个水平为1∶10、1∶15、1∶20。

2.2 正交实验结果

为了优化芩莲正积方水提取黄酮的提取工艺，根据单因素实验结果，按照L9（34）正交设计表进行实验，考察提取温度（A）、提取时间（B）和料液比（C）3 个因素的正交设计对芩莲正积方中总黄酮提取率的影响，得到9 组正交实验结果见表4，方差分析结果见表5。

表4 正交实验结果Tab.4 Orthogonal experiment results

表5 方差分析Tab.5 Variance analysis

由表4 可知，R 值越大说明该因素对实验结果的影响越大，比较3 个因素的R 值，对芩莲正积方提取物中总黄酮提取率影响大的因素依次为提取时间（B）＞料液比（C）＞提取温度（A）。K 值越大说明该水平对实验结果的影响越大；对于A 因素：K3＞K1＞K2；对于B 因素：K2＞K1＞K3；对于C 因素：K2＞K1＞K3。以上结果说明芩莲正积方总黄酮的最佳提取工艺为A3B2C2，即浸泡时间0h、提取次数1 次、提取温度90℃、提取时间60min、料液比1∶15，在该提取工艺下得到的芩莲正积方提取物中总黄酮提取率最高。

由表5 可见，提取时间（B）能够显著影响芩莲正积方水提物中总黄酮提取率（P＜0.05），而提取温度（A）和料液比（C）对芩莲正积方水提物中总黄酮提取率没有显著影响。

2.3 最佳水提取工艺验证实验

在上述所得的最佳提取工艺条件下平行提取3次进行验证，结果见表6。

表6 最佳工艺验证（%）Tab.6 Optimum process verification

由表6 可见，芩莲正积方总黄酮提取率为6.76%，RSD 为0.55%。说明此最佳工艺稳定且合理。

3 结论

芩莲正积方临床上通常采用水煎煮提取法，但由于提取温度、提取时间、溶剂量、浸泡时间和提取次数等条件的变化均能导致中药复方的黄酮提取率不同，因而使疗效的发挥程度有异。本文通过单因素实验和正交实验，得到在浸泡时间0h、提取次数1次、提取温度90℃、提取时间60min、料液比1∶15 的提取工艺条件下，芩莲正积方水提物中总黄酮提取率最高，为6.76%。该结果为提高方中有效成分总黄酮的溶出提供了借鉴方法。