余甘子多酚提取工艺及测定方法研究进展*

王 欣，郝 岩，杨鑫淼，孙莉欢，赵晋彤

（哈尔滨商业大学，黑龙江 哈尔滨 150076）

余甘子（Phyllanthus emblica L.）为大戟科叶下珠属植物余甘子的果实，在我国西南等地区分布广泛，是我国药食两用的传统药材之一，具有清热凉血、消食健脾、生津止咳等药效[1]。余甘子内富含多酚类、萜类、维生素及各种微量元素等多种活性成分[2]，大量研究表明，余甘子多酚具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、护肝、降血糖、免疫调节等多种药理作用[3]，在药物研发及食品保健等方面具有广阔的前景。因此，余甘子多酚的高效提取对后续的深入研究及产品开发具有重要意义。本文在现有文献报道的基础上，对余甘子多酚的多种提取工艺及测定方法进行梳理综述，以期为余甘子多酚的高效利用提供理论依据及参考。

1 余甘子多酚的提取工艺

1.1 溶剂浸提法

溶剂浸提法作为多酚提取中的传统方法，对于溶剂的选择，首先，要求溶剂能够较好地溶解多酚，其次，还要考虑其极性及安全性等性质。提取多酚类化合物所用溶剂多为有机溶剂，例如甲醇、乙醇、丙酮等。曹维等[4]以广东普宁产余甘子鲜果实为原料，通过正交实验对余甘子多酚的最佳提取工艺进行优化。首先，对3 种不同提取溶剂（50%甲醇、80%乙醇、蒸馏水）进行考察，结果表明，50%甲醇提取得到的多酚含量为3.6%，提取效果最佳。进而通过正交实验得出影响多酚提取效果的因素依次为料液比>提取次数>提取时间，且当料液比为1∶10、提取时间为90min、提取次数为1 次时，多酚含量达到最高。吴丹玲等[5]在余甘子多酚提取条件优化的研究中，以水及不同浓度的丙酮、甲醇、乙醇作为提取溶剂，对余甘子多酚进行提取，并对提取溶剂的浓度及提取次数进行优化实验。实验结果表明，水提取5次、70%丙酮提取3 次、70%甲醇提取4 次、80%乙醇提取3 次的多酚提取率均在96%以上。其中，当70%丙酮提取3 次时，所得多酚含量最高，可达到17.21g·kg-1。甘瑾等[6]以乙醇为提取溶剂对余甘子果渣多酚进行提取，在单因素实验基础上，以提取温度、乙醇体积分数、提取时间为考察因素，以多酚提取量为指标，采用三因素三水平的Box-Behnken 响应面实验，对余甘子果渣中的多酚进行了提取优化。以此确定出余甘子果渣多酚的最佳提取条件为：提取温度60℃、乙醇体积分数60%、提取时间80min、料液比1∶33（g∶mL），在此条件下多酚的提取量为126.25mg·g-1。杨冰鑫等[7]选用四川产余甘子鲜果实为研究对象，通过单因素实验筛选出浸提时间、浸提温度和乙醇浓度3 个因素对总多酚提取影响较大，进一步采用正交实验优化提取工艺。当浸提时间为135min、浸提温度为70℃、乙醇浓度为45%时，总多酚含量为（0.2427±0.008）mg GAE·mg-1。

溶剂浸提法较其他提取方法来说，操作简单、可行性高、整体实验更为稳定，但其提取时间较长且得率较低，同时，有机溶剂消耗量大且成本较高。

1.2 酶解辅助提取法

植物细胞壁由纤维素、半纤维素及果胶等构成，因此，可以选用相应的生物酶水解这些组成成分，以达到破坏植物细胞壁，有利于其中活性物质提取的目的。提取生物活性物质常用的生物酶类有纤维素酶、果胶酶及木瓜蛋白酶等。王小艳等[8]采用了酶解辅助法提取余甘子多酚并测定总多酚的含量。在单因素实验的基础上，设计正交实验L16（45）进行工艺优化，以总多酚的提取率作为参考指标，最终确定余甘子总多酚的最佳提取工艺为：纤维素酶和果胶酶比例为1∶1、总加酶量为2%、提取温度60℃、料液比1∶30（g∶mL）、最适pH 值为4.0、恒温低速振荡、提取时间为4h，总多酚提取率为13.68%。

酶解辅助提取法具有作用条件温和、提取率较高、有机溶剂使用量少等优点，但提取时间相对较长，且酶制剂成本较高。

1.3 超声波辅助提取法

超声波辅助提取法是在超声波所产生的空化作用和机械作用下，使组织细胞发生破裂，进而在超声波高频振动作用下，能够促进多酚类物质的溶出和扩散。黄秋萍等[9]以丙酮为提取试剂，通过设计单因素实验与正交实验，对超声波辅助提取余甘子果核多酚工艺条件进行了优化。结果表明，最佳提取条件为：体积分数70%的丙酮、料液比1∶4（g∶mL）、提取温度40℃、提取时间30min，在此条件下，余甘子果核多酚的提取率为7.37%。林长彬等[10]以乙醇为提取试剂，以余甘子总多酚的提取量为评价指标，采取单因素实验结合Box-Behnken 响应面法，探究乙醇浓度、超声时间、超声温度对余甘子多酚提取工艺的影响，并对其提取工艺进行优化。结果表明，余甘子多酚提取的影响因素为乙醇浓度>超声温度>超声时间；最佳提取条件为：乙醇浓度64%、超声时间39min、超声温度43℃，余甘子总多酚的提取量可达186.17mg·g-1。Tsai 等[11]选取提取时间、乙醇浓度及超声频率等影响因素，通过L9（34）正交实验设计对超声辅助提取余甘子多酚的工艺进行优化，结果表明，以70%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶50（g∶mL），在提取时间为15min、提取温度60°C、超声频率为56kHz 的条件下，酚类化合物的浸出量达55.34mg·g-1，其得率可达56.82%。而常规溶剂（70%乙醇）萃取酚类成分的产率为16.78%，远低于超声辅助提取法。

超声波辅助提取法操作简便、提取时间短且效率高，作为新型提取方法，具有广阔前景。

1.4 微波辅助提取法

微波辅助提取法是指电磁波与极性化合物相互作用时所产生热量，能够提高提取溶剂的温度，进而增加溶剂在样品中的渗透率，同时高温可破坏植物细胞组织结构和细胞壁，更有利于活性成分的溶出。李洁等[12]采用微波-热水浸提法对余甘子多酚进行提取，并通过单因素实验和正交实验对最佳提取工艺进行优化。在微波功率640W 条件下处理3min，料液比为1∶20（g∶mL），在50°C 下浸提6min 后，与传统的热水浸提法相比，总酚提取量提高了50.26%。Li 等[13]选用产自福建省惠安县的余甘子进行研究，通过响应面分析法，以总多酚含量为评价指标，对微波功率、辐照时间、乙醇浓度及料液比进行优化，确定其最佳提取工艺：在微波功率为480W，辐射时间29s、乙醇浓度为66%、料液比为1∶25（g∶mL）的条件下，总酚含量可达（133.58±15.61）mg·g-1。

因此，微波辅助提取法因其提取效率高、绿色环保等优点被广泛用于植物多酚的提取。

1.5 亚临界水萃取法

亚临界水萃取法是以水作为提取溶剂，在温度为100～374℃之间时，通过改变压力使其仍然保持液体状态。亚临界状态下，亚临界水的氢键强度会随着温度的升高而减弱，使其具有与有机溶剂相似的性质，有利于提取率的增加[14]。该方法已被广泛应用于多酚、多糖以及精油等天然产物提取，且提取效果较好。唐仕荣等[15]以余甘子干果粉作为实验材料，通过设计单因素实验探究了亚临界水萃取余甘子多酚的提取条件，进而利用响应曲面分析法对提取工艺进行优化。得到最佳提取条件为：余甘子干果粉碎过40 目筛、纯水80mL、液料比47∶1（mL∶g）、亚临界萃取温度212℃、提取时间11min，此时余甘子多酚的平均提取率为17.08%。李晓强等[16]采用5 种提取方法（亚临界水提取法、溶剂提取法、微波-热水提取法、微波提取法、超声波提取法）对5 个产地（广东、广西、福建、云南、海南）的余甘子多酚进行提取并比较其提取效果。结果表明，在不同产地中，产自云南的余甘子中多酚含量最高，可达345.24mg GAE·g-1，继而选取云南余甘子，评估不同方法的提取效果，其中亚临界水提取所得余甘子多酚含量最高，为387.33mg GAE·g-1。

亚临界水萃取法具有无需利用有机溶剂且提取时间短、提取率高、价廉易操作等优点，是极具开发潜力的绿色、高效提取技术。

2 测定方法

2.1 紫外-可见分光光度法

紫外-可见分光光度法是常见的光谱学测量方法，常用于多酚类成分的测定。亓旗等[17]采用三氯化铁-铁氰化钾比色法，以没食子酸为对照品，对余甘子提取物中总酚含量进行测定。该方法平均回收率为101.57%，相对标准偏差（RSD）为2.65%。王宬研等[18]通过Folin-Ciocalteu 试剂比色法对余甘子的乙醇-水溶液提取物中的多酚含量进行测定，样品中总多酚含量为77.8%。

紫外-可见分光光度法具有操作简便、灵敏准确、仪器易得及降低检测成本等优点。

2.2 色谱法

液相色谱法具有高效高速、灵敏度高、易操作等优点，也常用于多酚类成分的检测。吴玲芳等[19]建立高效液相色谱法（HPLC）对8 个不同产地的余甘子药材中的8 种成分（没食子酸、安石榴苷B、没食子酸甲酯、老鹳草素、柯里拉京、诃子林鞣酸、诃黎勒酸和鞣花酸）进行含量测定。采用Diamonsil C18色谱柱（250×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-0.2%冰醋酸水溶液，检测波长为270nm。结果表明，不同产地的余甘子药材中主要成分含量具有一定差异，其中产自尼泊尔的余甘子所含的没食子酸、诃黎勒酸和鞣花酸含量较高，产自印度的余甘子所含的安石榴苷B 和没食子酸甲酯含量较高，而产自四川的余甘子所含老鹳草素含量最高。于涛等[20]建立超高效液相色谱法（UPLC）对余甘子中的没食子酸和葡糖倍苷的含量进行测定。采用CAPCELL PAK C18MG 色谱柱（150×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液，检测波长为273nm。结果表明，两种成分质量浓度与峰面积在测定范围内均呈现出良好的线性关系，平均加样回收率分别为100.57%和99.22%。利用该方法对3 批中试规模加工获得的余甘子原料药进行检测，两种成分含量之和均高于50%以上。所建立的方法可用于余甘子总酚原料的质量控制。

2.3 多方法联合测定

超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱（UPLCESI-QTOF-MS）联用技术具有高分辨率、高灵敏度、高质量精度等优点，是复杂未知样品中化学组成分析、鉴定的重要工具，为中药质量控制研究提供了高效地分析手段。Wu 等[21]建立UPLC-ESI-QTOF-MS方法对余甘子多酚提取物进行分析，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100×2.1mm，1.7μm），流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为乙腈-0.1%甲酸水溶液，进行梯度洗脱。结果表明，余甘子中含有大量的酚酸，主要包括15 种羟基苯甲酸和10 种羟基肉桂酸，例如没食子酸、丁香酸、鞣花酸以及咖啡酸、绿原酸。

3 结语

我国余甘子资源丰富，多酚类化合物是余甘子的主要活性成分，且具有多种药理活性，在预防及治疗各种疾病方面已被广泛应用。因此，对余甘子中多酚类成分的提取工艺进行探索及优化具有重要的意义。目前，所应用的提取方法均较为传统，应尝试采用新技术，如超临界提取、双水相提取、低共熔溶剂提取等对余甘子多酚进行高效提取。对于总酚含量的测定多选用紫外-分光光度法，而对于单一成分的测定则需要选择准确度、精密度较高的色谱法及联用检测技术。