HPLC测定伏立康唑血浆药物浓度及其临床应用

刘任祝,胡毅翔,闫庆梓,刘湘

伏立康唑是在氟康唑结构基础上合成的一种新型三唑类广谱抗真菌药,主要对急性侵袭性曲霉菌、耐氟康唑严重的侵袭性念珠菌属、足放线病菌属和镰刀菌属有良好的抗菌活性[1]。伏立康唑通过抑制真菌麦角甾醇生物合成,从而发挥抗真菌作用,目前已成为治疗侵袭性曲霉菌病和耐氟康唑的光滑念珠菌、克柔念珠菌和白色念珠菌感染的首选药物。

伏立康唑由CYP2C19介导代谢,具有代谢饱和性,使其体内呈非线性药动学,个体差异大。通过监测伏立康唑体内药物浓度,从而预测临床疗效及避免不良反应[2-3]。伏立康唑主要监测体内用药谷浓度,可用于制定个体化给药方案提高疗效,确保用药安全。当伏立康唑谷浓度>2 μg/ml,可获得88%以上的临床有效率,当谷浓度≤2 μg/ml有效率仅有54%;当谷浓度为5～6 μg/ml时,神经毒性、视觉障碍和肝毒性等不良反应发生率明显升高[4-5]。研究发现伏立康唑血药浓度个体差异大,影响因素包括年龄、肝肾功能、CYP2C19基因多态性,以及由CYP2C19介导的药物相互作用等[6]。相关文献报道激素、利尿剂等使用,以及患者感染程度也可能是影响伏立康唑血药浓度的因素[7-8]。但由于缺乏大样本、高质量的随机对照研究,现阶段还未有一个可信的伏立康唑治疗浓度范围,且临床疗效及安全性方面的评估仍存在较大差异。治疗药物监测(TDM)可通过测定血液或其他体液中药物浓度并利用药代动力学原理和公式使给药方案个体化,以提高药物疗效,避免或减少不良反应,同时也为药物过量引发不良反应/事件的诊断和处理提供有意义的临床依据。临床药师根据TDM结果,为患者提供个体化用药方案,参与临床诊疗实践,使临床用药更加安全、有效、合理。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 LC-20AT高效液相色谱仪(包括SIL-20A自动进样器、LC-20AT二元泵、SPD-20A紫外检测器、CTO-10AS柱温箱、DGU-20A在线脱气机,日本岛津公司);Mini plus离心机(eppendorf公司);ME104电子天平(梅特勒托利多);FE28 pH计(梅特勒托利多);EASY系列超纯水机(Heal Force)。伏立康唑对照品(中国药品生物制品检定所);甲醇、乙腈(色谱纯,国药集团化学试剂公司),磷酸、甲酸、硫酸锌均为分析纯;水为超纯水(自制)。患者血浆由湘潭市中心医院各临床科室提供;健康人空白血浆由医院输血科提供。

1.2 溶液配置 (1)标准储备液：精密称取伏立康唑对照品各10 mg,甲醇溶解,转移至10 ml容量瓶中定容,配置成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液,-20 ℃保存备用。(2)对照品工作液：取1 000 mg/L的标准储备液2 ml置于50 ml容量瓶中,用10%甲醇定容,配置成质量浓度为40 mg/L的标准储备液,4 ℃保存备用。(3)0.1%甲酸：精密量取甲酸1 ml置于1 000 ml容量瓶中,加水定容至刻度,真空泵抽滤,超声脱气,配置成0.1%甲酸冲液,4 ℃保存备用。(4)硫酸锌溶液：精密称取七水硫酸锌4.459 1 g,用50%甲醇溶解并转移至50 ml容量瓶中定容,配置成5%硫酸锌(50%甲醇溶解、pH值3)的硫酸锌溶液,4 ℃保存备用。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件：色谱柱：岛津Inertsil ODS-4 C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相：0.1%甲酸∶乙腈=63∶37;流速：1 ml/min;检测波长：255 nm;进样量：50 μl;柱温：30 ℃。

1.3.2 标准曲线和质控品制备：精密量取对照品工作液适量,用空白血浆稀释20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/L各200 μl。另取对照品工作液适量,用空白血浆稀释成2.5、5、10 mg/L,并分装成200 μl数管,-20 ℃保存备用。

1.3.3 样品处理：精密量取200 μl血浆样品,加入200 μl 5%硫酸锌(50%甲醇溶解、pH值3)溶液,涡旋混匀30 s,12 000 r/min离心5 min,取上清液50 μl进样。

2 结 果

2.1 专属性试验 分别取空白血浆、加入伏立康唑对照品的血浆按1.3.3方法处理后分析,考察内源性物质的干扰。结果表明,对照品溶液、空白血浆和流动相中的内源性物质不干扰样品峰,伏立康唑的保留时间为10.624 min。色谱图见图1、图2。

图1 空白血浆色谱图

图2 加入伏立康唑对照品的血浆色谱图

2.2 标准曲线的绘制 在1.3.3方法处理后标准品系列溶液,测定伏立康唑峰面积,以峰面积为横坐标,系列溶液浓度为纵坐标进行线性拟合。伏立康唑标准曲线回归方程为Y=2.068 35×104X-6 599.46(R=0.999 4,R2=0.998 9,RSD%=9.002)

2.3 方法回收率试验和精密度试验 取1.3.2配置好的低、中、高浓度为2.5、5、10 mg/L血浆样品各5份,按1.3.2方法处理后分析,计算日内精密度和方法回收率均值,方法回收率=(实测浓度/目标浓度)×100%;连续测定5 d,计算日间精密度。方法回收率、日内精密度、日间精密度见表1。

表1 伏立康唑方法回收率、日内精密度、日间精密度 (n=5)

2.4 稳定性试验 取1.3.2配置好的低、中、高浓度为2.5、5、10 mg/L血浆样品各5份,按1.3.2方法处理,将上清液4 ℃放置0、4、24、48 h后重复测定,计算变异系数(CV%),血浆样品稳定性见表2。

表2 伏立康唑血浆样品稳定性 (n=5)

2.5 患者血药浓度测定结果 2019年1月—2022年7月,医院采用上述方法测定伏立康唑血药浓度598例,按临床专科统计学分类,以呼吸科、重症监护室、血液科、感染科居多。测定结果在目标范围(0.5～5.0 mg/L)内的有411例(68.73%),<0.5 mg/L患者中18例低于检测限值;>5.0 mg/L的有155例(25.92%),最高浓度为16.36 mg/L,而按目标范围(1.0～5.5 mg/L)内的有402例(67.22%),见表3。

表3 2019年1月—2022年7月医院患者伏立康唑血药浓度测定结果

3 讨 论

本文通过参考文献[9-11]报道利用高效液相色谱法(HPLC)测定伏立康唑,选取适合本实验室的仪器参数和处理方法,建立一种较为精确、实用的伏立康唑测定方法,并根据监测结果,对临床应用伏立康唑素实施全程药学监护,避免不良反应发生,为临床个体化用药提供科学依据。

3.1 样品前处理、流动相选择 关于样品前处理,国内外采用的方法主要有固相萃取法、液液萃取法和蛋白沉淀法。固相萃取法成本较高、操作复杂,液液萃取操作复杂,而蛋白沉淀法操作简单、成本较低,故一般选取蛋白沉淀法。选择合适蛋白沉淀剂处理样品可减少内源性物质对测定的干扰,一般为有机溶剂、重金属盐等。黄晓会等[12]文献报道,选择5%硫酸锌效果较好。本文使用甲醇、5%硫酸锌、10%硫酸锌、5%硫酸锌(50%甲醇溶解)、10%硫酸锌(50%甲醇溶解)、5%硫酸锌(50%甲醇溶解、pH值3)、10%硫酸锌(50%甲醇溶解、pH值3)做蛋白沉淀剂进行比较,发现甲醇沉淀效果较好,但回收率较低。硫酸锌沉淀效果较好,但常温下离心后,静置短时间内出现浑浊,回收率>90%。使用50%甲醇(pH值3)溶解硫酸锌做蛋白沉淀剂,沉淀完全,回收率基本维持在90%,但同样硫酸锌也会产生一定色谱吸收,故本文选用5%硫酸锌(50%甲醇溶解、pH值3)作为蛋白沉淀剂处理样品。

文献报道HPLC测定伏立康唑采用的流动相大多为一定浓度的甲酸,其主要目的是为调节流动相pH,从而改善峰型和解决样品峰拖尾。本文使用0.5%、0.3%、0.1%甲酸及不同比例的甲醇、乙腈,综合考虑保留时间、峰型、pH值对色谱柱及仪器损伤、空白血浆及内源性物质存在的干扰,最终选择0.1%甲酸∶乙腈=64∶37作为流动相。

3.2 临床样本监测结果分析 目前国外文献报道,伏立康唑血药浓度范围大多定在1.0～5.5 mg/L[13-15];而中国药理学会治疗药物监测委员会发布的《中国伏立康唑个体化用药指南》推荐伏立康唑目标血药浓度范围为0.5～5.0 mg/L,主要考虑当血药浓度>5.0 mg/L的亚洲患者肝毒性发生率升高,同时考虑血药浓度≥0.5 mg/L患者感染治疗有效率会更高。但从医院伏立康唑TDM患者数据来看,若血药浓度范围设定为0.5～5.0 mg/L,达标率升高,主要处于0.5～1.0 mg/L范围内例数比5.0～5.5 mg/L多9例。同时在临床实践过程中,观察到血药浓度处于5.0～5.5 mg/L时,部分患者出现幻视和轻度肝功能损伤的几率升高,因此对中国人群,伏立康唑血药浓度监测范围设定为0.5～5 mg/L能提高感染治疗有效率,同时降低不良反应发生率。

综上所述,临床药师通过监测伏立康唑血药浓度,及时建议医师调整给药方案,有助于临床个体化给药方案制定,在达到有效治疗前提下减少药物不良反应和耐药性产生,使其临床应用更加合理。临床药师在实际工作中,应熟知患者临床症状和相关检查结果,合理利用血药浓度监测及基因检测等手段,制定个体化给药方案,为临床合理化用药提供理论依据。本研究由于临床实践复杂性,对根据检测结果调整给药方案后仅通过临床效果验证,未建立群体药动学模型预测伏立康唑血药浓度,存在一定不足。未来应收集更多样本,建立伏立康唑群体药动学模型进行验证,为临床用药提供更加科学的依据。

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