超声联合果胶酯酶优化低酯山楂果胶提取工艺研究

李志伟，马 勇，陈 洋，盘赛昆

（江苏海洋大学食品科学与工程学院，江苏连云港 222000）

果胶广泛存在于植物的果实、根、茎、叶中，是细胞壁的一种组成成分，基本组成的部分为甲酯化半乳糖醛酸[1]。果胶按其甲酯化的大小可以分为高酯果胶（HMP） 和低酯果胶（LMP） 两类。HMP 一般是是甲酯化度高于50%，即甲氧基含量高于7%的果胶；LMP 是指甲酯化度介于25%～50%，即甲氧基含量低于7%的果胶[2]。果胶的用途很广，70%的果胶用于食品添加剂行列，两类果胶的区别在于胶凝机理的不同[3]。HMP 受限于pH 值和共熔物的制约，只能用于高糖食品的生产。LMP 形成凝胶的条件不受限于pH 值和共熔物，只需要足够的高价金属离子就可以形成胶体。LMP 能够出色地满足人们对低糖、低盐、低热量食品的要求[4]。最近几年来，世界上糖尿病患者呈上升趋势，减肥成为一种时尚，商家针对这一特性开发出了一系列低糖保健食品，在选择用胶时，LMP 有着巨大的优势。

山楂作为我国特有原产果树，内含丰富果胶，在现有水果中果胶含量位居首位，是制备低酯果胶的优秀原材料[5]。利用山楂中固有的果胶酯酶并采用超声辅助提取低酯果胶，对提取的低酯果胶进行基本成分测定。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

山楂，市售；乙醇，无锡源之泉化工产品有限公司提供；Na2CO3，安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 主要设备

恒温干燥箱，吴江富盛烘箱设备有限公司产品；超微粉碎机，潍坊新亚能粉体设备有限公司产品；电子天平，南北仪器有限公司产品；低速离心机，湖南凯达科学仪器有限公司产品；真空干燥箱，吴江市埃尔特电热设备有限公司产品；超声细胞破碎仪，南京先欧仪器制造有限公司产品；恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司产品。

1.3 工艺流程

1.4 操作要点

（1） 原料处理。山楂去核去蒂后，放入恒温干燥箱中去除水分，将山楂置于超微粉碎机中粉碎。

（2） 脱酯。将原料中加入适量的水得到料液，再加入Na2CO3，利用超声细胞破碎仪进行脱酯工作。

（3） 热水浸提。将料液放入水浴锅中加热搅拌3 h，用离心机以转速4 000 r/min 离心10 min，收集上清液。

（4） 浓缩。将上清液置于旋转蒸发仪中浓缩至30%，去除上清液中的水分。

（5） 乙醇沉淀：将浓缩后的上清液中加入1.5 倍体积的95%乙醇溶液，沉淀出果胶。

（6） 成品果胶。将沉淀物放入真空干燥箱中烘干、粉碎后，即得果胶成品。

1.5 单因素试验

分别考查不同料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL） 对山楂果胶提取率的影响；不同激活剂质量6%，10%，14%，18%，22%对山楂果胶提取率的影响；不同超声时间30，60，90，120，150 min 对山楂果胶提取率的影响；不同超声功率215，250，285，320，355 W 对山楂果胶提取率的影响。

1.6 响应面试验

以单因素试验结果为指标，低酯山楂果胶提取率作为响应值，将料液比、激活剂质量、超声时间、超声强度作为影响因子，进行四因素三水平试验，并对结果进行验证，利用Design Expert.12 进行试验设计与分析，优化超声波辅助内源酶提取低酯果胶生产工艺[6]。

1.7 低酯果胶得率的测定

果胶得率按如下公式计算：

1.8 低酯果胶甲氧基含量的测定

用分析天平准确称取1.0 g 果胶粉末，将其完全溶解在100 mL 蒸馏水中，在果胶溶液中加入2～3 滴酚酞溶液，用浓度为0.1 mmol 的NaOH 滴定果胶溶液，使溶液滴定至红色0.5 min 内不褪色为终点。再加入浓度为0.5 mmoL 的NaOH 溶液5 mL，于25 ℃环境下皂化2.5 h。用浓度为0.1 mol/L 的H2SO4溶液滴定至果胶溶液红色消褪为止[7]。计算公式如下：

式中：V1——皂化时加入的氢氧化钠体积，mL；

C1——皂化时加入的氢氧化钠浓度，mol/L；

V2——滴定皂化后剩余碱液的硫酸体积，mL；

C2——滴定皂化后剩余碱液的硫酸浓度，mol/L；

m——试样质量，g；0.031——甲氧基毫摩尔数。

1.9 低甲氧基果胶质构特性的测定

配制含有15%蔗糖、0.1%黄原胶、0.9%卡拉胶的混合液，然后加入提取的低甲氧基山楂果胶，80 ℃加热搅拌至胶完全溶解，使果胶粉含量为0.1%，溶液冷却后，再加入柠檬酸，搅拌均匀，使柠檬酸质量分数为0.1%。将调配好的料液85℃水浴保持15 min杀菌，密封，4 ℃下冷藏静置18 h 即成凝胶。同时，制备未添加果胶的凝胶和加入等量商品柑橘果胶的凝胶样品，进行对照试验。

1.10 理化指标检测

采用苯酚- 硫酸法测定山楂果胶的总糖含量[8]；采用福林酚比色法测定山楂果胶的多酚含量[9]；采用考马斯亮蓝法测定山楂果胶的蛋白质含量[10]；采用皂化滴定度法测定果胶的酯化度[11]；采用化学滴定度法测定果胶的酰胺化度[12]；参照国标GB 5009.3—2016直接干燥法测定果胶的水分含量。

1.11 果胶酯酶的活力检测

用pH-stat 法进行检测。用天平称取5 g 山楂粉放入100 mL 的质量分数为6%的NaCl 溶液中，于2 ℃环境温度下以转速8 000 r/min 离心20 min，取上清液作为粗酶液。称取0.5 g 山楂果胶溶于100 g 蒸馏水中形成山楂果胶溶液，将溶液置于45 ℃环境温度下恒温并调pH 值至7.5，加入2 mL 粗酶液后开始计时，用浓度为0.01 mol/L的NaOH 溶液将pH 值稳定在7.5[14]。

1.12 数据统计分析

所有试验进行3 次平行试验取平均值进行数据分析，以“平均值±标准偏差”表示（n=3），采用Origin pro 18.0，Excel 和Design Expert.12 软件对试验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 山楂中果胶酯酶的活力

果胶酯酶作用时间与消耗NaOH 的关系见表1，PE 的作用曲线见图1。

图1 PE 的作用曲线

表1 果胶酯酶作用时间与消耗NaOH 的关系

根据回归方程Y=14.766X-17.78 可知，斜率为14.766，由此可以得到山楂中的果胶酯酶活力为14.766 μmol/s，根据酶的活力发现可利用果胶酯酶对山楂中的果胶进行脱酯，制备低酯山楂果胶。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 果胶酯酶激活剂对低酯果胶提取率的影响

果胶酯酶激活剂对低酯果胶提取率的影响见图2。

图2 果胶酯酶激活剂对低酯果胶提取率的影响

由图2 可知，激活剂添加量为6%～10%时，果胶提取率迅速上升，提取率最高达到29.72%。激活剂浓度较低时，随着添加量的增加，使得果胶酯酶的活性增强，脱酯反应速率加快，甲氧基含量迅速降低；但随着激活剂添加量达到一定程度，山楂中的果胶酯酶活性被消耗殆尽，过多的激活剂使得断开的甲酯键和糖苷键重新链接，使得酯化度上升[15]。综合考虑，激活剂添加量选择10%为佳。

2.2.2 料液比对低酯果胶提取率的影响

料液比对低酯果胶提取率的影响见图3。

图3 料液比对低酯果胶提取率的影响

由图3 可知，料液比为1∶10 ～1∶25 时，低酯果胶的提取率随着料液比的增大而增加，在1∶25时果胶提取率达到24.63%。当料液比为1∶25 ～1∶30 时，果胶提取率随着料液比的增大开始降低。当料液比为1∶10 ～1∶25 时，随着水的占比增加，使得原料内外压强产生差距，能够让果胶物质从原料中较完全析出，提高果胶的提取率，但随着水的比例过于增加，原料内外的压强差距过大，原料中的果胶物质无法从原料中析出，果胶提取率开始下降[16]。所以，料液比以1∶25 为佳。

2.2.3 超声时间对低酯果胶提取率的影响

超声时间对低酯果胶提取率的影响见图4。

图4 超声时间对低酯果胶提取率的影响

由图4 可知，超声时间的长短会使原料具有不同的果胶提取率。当超声时间为120 min 时原料的低酯果胶提取率达到峰值28.5%，超声波的产能和剪切力的作用使得热量被聚集起来，给了果胶物质良好的析出环境，但随着超声时间的延长，会使得温度过高，开始破坏果胶的物质结构，从而使果胶提取率降低[17]。因此，超声时间选择120 min 较好。

2.2.4 超声功率对低酯果胶提取率的影响

超声功率对低酯果胶提取率的影响见图5。

图5 超声功率对低酯果胶提取率的影响

由图5 可知，超声功率的不同会导致不同的果胶提取率。当超声功率为285 W 时，低酯果胶的提取率达到了37.3%，随着超声功率的增强，使得果胶中的部分水溶性果胶溶解，同时因为果胶酯酶的影响，过强的超声功率会导致果胶中的结构断裂，降低果胶提取率。因此，超声功率选择285 W 为佳。

2.3 响应面试验结果分析

2.3.1 模型建立及显著性检验

响应面试验设计与结果见表2，回归统计分析结果见表3。

表2 响应面试验设计与结果

表3 回归统计分析结果

由表3 可知，该回归模型显著（p＜0.05），所有二次项的p均小于0.05，表明所选因素对果胶提取率均有显著影响。模型失拟项不存在显著面（p＞0.05），表明实际值与预估值之间相差较远，表明方程拟合性好，试验误差小。依据各因素显著水平与F值大小进行分析，各因素对果胶提取率影响从高到低为超声时间（C） ＞激活剂添加量（A） ＞料液比（B） ＞超声功率（D），并且所有试验果胶甲氧基含量均小于7%。

以激活剂添加量（A）、料液比（B）、超声时间（C）、超声功率（D） 为自变量，山楂低酯果胶提取率为因变量，对各组合处理得到山楂粗果胶提取率进行二次回归分析[18]，建立多元二次响应面回归模型：

2.3.2 响应面分析

各因素响应曲面和等高线见图6。

图6 各因素响应曲面和等高线

响应面图能够直观地反映出各个单因素对响应值的作用，也能够看出各个因素相互之间的影响效果。图6（a） ～6（d） 的等高线更接近椭圆形说明因素B和C的交互作用对果胶提取率的影响显著；图6（e） 和6（f） 的等高线图更接近圆形，说明两因素间的交互作用不明显，交互作用分析结果与方差分析表中的结果相一致。

2.3.3 最佳工艺条件的预测与模型验证

由单因素试验和响应面试验可以发现，最优加工工艺条件为激活剂添加量12.28%，料液比1∶26（g∶mL），超声时间119 min，超声功率288 W，响应面试验结果为26.79%，对此结果进行验证，发现低酯果胶提取率为（25.84±0.12） % ，理论值与实际值无显著性差异，证明了该试验结果的可行性。

2.4 果胶甲氧基含量的测定

低酯果胶甲氧基含量测定结果见图7。

图7 低酯果胶甲氧基含量测定结果

由图7 可知，对单因素试验提取的果胶进行甲氧基含量的检测，检测结果显示提取出的果胶甲氧基含量均在7%以下，属于低甲氧基果胶，即低酯果胶。

2.5 果胶质构特性的测定

低酯山楂果胶的凝胶质构特性见表4。

表4 低酯山楂果胶的凝胶质构特性

由表4 可知，与未添加果胶的凝胶样品进行对比，添加山楂果胶与低酯山楂果胶后，凝胶样品的质构特性均有明显提高，其中添加低酯山楂果胶样品的硬度、弹性和黏聚性略大于添加山楂果胶的样品。表明提取的低酯山楂果胶与市售的山楂果胶无显著性差异，能够达到商品果胶的使用效果。

2.6 理化指标检测结果分析

山楂低酯果胶理化指标见表5。

表5 山楂低酯果胶理化指标

由表5 可知，由最优工艺制作出的山楂果胶均符合干燥减量、二氧化硫、酸不溶灰分、总半乳糖醛酸、酰胺化度和重金属铅的含量等均符合GB 25533—2010 的要求。

3 结论

利用超声波辅助果胶酯酶进行提取低酯山楂果胶的优化，发现最佳方案为激活剂添加量12.28%，料液比1∶26（g∶mL），超声时间199 min，超声功率288 W，果胶提取率为（25.84±0.12） %，并对果胶的理化指标进行检测均符合国家标准GB 25533—2010 的相关要求。质构检测结果显示，添加低酯山楂果胶能够有效提升凝胶样品的质构特性且可达到商品果胶的使用效果。因此，可利用山楂来进行低酯果胶的制备，扩充低酯果胶的原料选择。