基于网络药理学及体外细胞实验分析生姜泻心汤治疗溃疡性结肠炎的潜在作用

熊诗琳，林小荷，黄松，侯少贞，刘昌辉，姜小艳，梁健

1.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006；2.深圳市中医院，广东 深圳 518033

溃疡性结肠炎（UC）发病始于直肠，通常以连续方式向近端延伸，穿过部分或整个结肠，是一种慢性结肠黏膜炎症性疾病。近年来，UC 在全球的发病率不断上升[1-2]。虽然目前临床治疗UC 的药物选择不断增多，包括肿瘤坏死因子（TNF）和小分子药物（Janus 激酶抑制剂）等[3-4]。但由于治疗药物存在价格昂贵、疗效不稳定和存在不良反应等问题，容易导致患者病情反复和产生耐药性等，而严重影响患者的生活质量[5]。尽管药物治疗选择扩大了范围，仍有10%～20%的UC 患者需要进行手术切除治疗[6]。而中医治疗可通过结合UC 的不同发病机制，发挥中药复方具有多靶点、整体调节等优势进行治疗[7]。

生姜泻心汤源自于《伤寒论》，由生姜、半夏、黄芩、黄连、人参、干姜、炙甘草和大枣组成，该方寒热并用，苦辛并施，是治疗胃肠道疾病的常用方药，具有使升降复、肠胃和之功[8-9]。由于中药复方具有多成分、多靶点、多通路等特点，本研究拟通过网络药理学，利用其从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物及其治疗对象之间的分子关联规律的优点，高效筛选和预测生姜泻心汤药物成分靶点，预测复方药物有效成分与治疗UC 相关靶点的作用机制，并采用分子对接技术和细胞实验加以验证。为生姜泻心汤临床治疗UC 以及后续实验研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞人结直肠腺癌细胞（Caco2 细胞）购于赛百慷（上海）生物技术股份有限公司；细胞培养于含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）基础培养基中，置于5%二氧化碳37 ℃的培养箱中培养。

1.2 实验试剂及仪器噻唑蓝（MTT）、脂多糖（LPS）购于碧云天生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购于上海麦克林生化科技有限公司；cDNA 逆转录试剂盒、TRIzol RNA 提取试剂和SYBR Green qPCR 试剂盒购于瑞真生物科技有限公司；重组兔单克隆抗体p53（48599）、兔单克隆抗体AKT1/2（48888）购自美国Signalway Antibody 公司；兔单克隆抗体IL-1β（EPR24895-116）购自美国Abcam 公司。CFXRCR 扩增仪购自美国BIO-RAD 公司；LSM800 蔡司激光共聚焦显微镜购自德国Carl Zeiss 公司；赛默飞Multiskan FC 型酶标仪、NanoDrop2000 核酸浓度检测仪购自美国Thermo Fisher 公司。

1.3 网络药理学预测

1.3.1 生姜泻心汤活性成分及作用靶点筛选分别以生姜泻心汤方所包括的单味中药（如生姜、半夏、黄芩、黄连、人参、干姜、炙甘草和大枣）为检索词，通过中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/index.php）检索其活性成分。筛选条件为：口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18，在Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）中检索各个靶点对应基因名称，整合去重处理后获得生姜泻心汤活性成分的预测靶点。

1.3.2 “复方-药材-活性化合物-靶标-疾病”的靶点获取及网络构建通过在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、TTD（https：//db.idrblab.net/ttd/）、Drugbank（https：//go.drugbank.com/）、PharmGBK（https：//www.pharmgkb.org/）数据库中输入关键词“ulcerative colitis”进行检索，将得到的所有靶点进行整理、去重、汇总。利用R.4.0.3 软件（https：//www.r-project.org/）筛选得到生姜泻心汤和UC 的共同靶点，并利用Cytoscape 3.7.0 软件构建生姜泻心汤治疗UC 的“复方-药材-活性化合物-靶标-疾病”网络，以Degree 值排序获取核心作用成分。

1.3.3 蛋白互作网络构建及网络拓扑分析在

STRING 数据库（https：//string-db.org/）导入交集靶点，并构建蛋白质-蛋白质相互作用网络图（PPI）。同时，将该物种设置为“homo sapiens”，所需的最小交互得分设置为0.9，并删除断开的节点。然后，将复杂蛋白质相互作用关系文件数据输入到Cytoscape 3.7.0 软件中，使用插件CytoNCA 计算节点的六个参数，即介数中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）、网络中心性（NC）和局部平均连通性（LAC）。最后，根据候选靶点的6 个参数应高于中位值原则来筛选核心靶点。

1.3.4 分子对接验证根据以上网络药理学分析结果，对核心组分以及核心蛋白进行模拟虚拟分子对接。于PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取核心化学组分的3D 结构式（包括AKT1、TP53 和IL-1β），于RCSB 蛋白质数据库（PDB，https：//www.rcsb.org/）获取靶点结晶结构。将其结果利用Maestro 软件进行结果处理和可视化。

1.4 细胞实验验证

1.4.1 MTT 分析将对数生长期的Caco2（1×103个/孔）细胞种于96 孔板中，培养12 h 后，加入不同浓度的生姜泻心汤（0、12.5、25、50、100、200 和400 μg/mL），干预24 h 后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），并于培养箱中孵育1～2 h，吸掉培养液，加入150 μL DMSO，随后使用酶标仪在450 nm 波长处测量每孔吸光度。将对数生长期的Caco2（1×103个/孔）细胞种于96 孔板中，培养12 h 后，给予LPS（1 mg/mL）刺激，同时加入不同浓度的生姜泻心汤（12.5、25、50、100、200 和400 μg/mL），干预24 h 后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），并于培养箱中孵育1～2 h，吸掉培养液，加入150 μL DMSO，随后使用酶标仪在450 nm 波长处测量每孔吸光度。

1.4.2 RT-PCR 分析生姜泻心汤干预后基因的表达将对数生长期的Caco2（1×105个/孔）细胞接种于6 孔板中，细胞贴壁后，将细胞分为Ctrl 组、LPS组、LPS+生姜泻心汤25 μg/mL 组、LPS+生姜泻心汤50 μg/mL 组和LPS+生姜泻心汤100 μg/mL 组5 组；Ctrl 组细胞给予等体积的培养基，LPS 组加入等体积的培养基（含有1 mg/mL 的LPS），各浓度的生姜泻心汤组加入对应浓度的生姜泻心汤，同时加入1 mg/mL 的LPS，干预24 h；收集每组细胞，用Trizol 试剂提取总RNA，测定RNA 的浓度，逆转录成cDNA，根据试剂盒说明书对样品进行PCR 扩增，PCR 引物如下：AKT1 正向为5′-AGCGACGTGG CTATTGTGAAG-3′，AKT1 反向为5′-GCCATCATTCT TGAGGAGGAAGT-3′；IL-1β 正向为5′-ATGATGGCT TATTACAGTGGCAA-3′，IL-1β 反向为5′-GTCGGAG ATTCGTAGCTGGA-3′；TP53 正向为5′-CAGCACAT GACGGAGGTTGT-3′，TP53 反向为5′-TCATCCAAA TACTCCACACGC-3′，GAPDH 作为内参。反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；循环40 次。根据公式2-△△CT计算目标基因的表达情况。

1.4.3 免疫荧光分析生姜泻心汤干预后蛋白的表达将Caco2（1×104个/孔）细胞接种于共聚焦培养皿中，细胞贴壁后，分为Ctrl 组、LPS 组及生姜泻心汤组。LPS 组及生姜泻心汤组给予LPS 刺激，此外生姜泻心汤组给予100 μg/mL 的生姜泻心汤干预24 h。各组细胞用4%多聚甲醛常温固定15 min，封闭、通透30 min，4 ℃过夜孵育一抗（anti-AKT1、anti-TP53和anti-IL-1β），室温孵育荧光二抗2 h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染，经共聚焦显微镜观察生姜泻心汤对靶蛋白的作用。

1.5 统计学方法采用SPSS20.0 统计学软件分析处理数据。计量资料符合正态分布以均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用成组t检验，同组治疗前后比较采用配对样本t检验；多组数据间比较采用单因素方差分析（ANOVA），若数据方差齐，采用LSD 检验；方差不齐，采用Dunnett′sT3 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生姜泻心汤活性成分及其治疗UC 潜在靶点预测结果见图1A。通过GeneCards 检索并使用中位数获取UC 核心靶点，得到靶点5 332 个，检索OMIM得到靶点7 个，检索TTD 得到靶点40 个，检索PharmGKb 得到靶点15 个，检索DrugBank 得到靶点11 个，合并去重得到UC 靶点5 186 个。见图1B。通过中药系统药理数据库和文献检索等方式，以OB值和DL 值为依据，共得生姜泻心汤有效活性成分215 个。其中半夏13 个，大枣29 个，甘草91 个，干姜5 个，黄连14 个，黄芩36 个，人参22 个，生姜5 个，将所有活性成分整合去重后得到191 种唯一的活性成分，其中191 种唯一活性成分中有247 个对应靶点。根据筛选去重后的生姜泻心汤有效活性成分对应的靶点，利用Venny 2.1 绘制韦恩图，得到UC 靶点与生姜泻心汤药物活性成分靶点的共同靶点171 个，即生姜泻心汤治疗UC 的潜在作用靶点。

图1 生姜泻心汤治疗UC 的潜在靶点

2.2 “复方-药材-活性化合物-靶标-疾病”的靶点获取及网络构建结果见图2。将交集靶点导入Cytoscape 3.7.0 软件构建生姜泻心汤治疗UC 的“复方-药材-活性化合物-靶标-疾病”网络图，生姜泻心汤活性成分-UC 靶点关联网络存在338 个节点与2 416 条关系。

2.3 蛋白互作网络构建及网络拓扑分析结果见图3。在STRING 数据库检索得到171 个交集重叠蛋白，并生成一个复杂的PPI 网络。

2.4 蛋白互作网络构建及网络拓扑分析结果见图4A。Cytohubba 分析PPI 网络中的重叠蛋白，发现AKT1、TP53、EGFR、HIF1A、JUN、CTNNB1、CASP3、IL-1β 和STAT3 等蛋白具有更高的重叠程度。见图4B。根据拖拓扑参数（6 个参数，包括Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC 和Network）排序，最终确定AKT1、TP53、IL-1β 为核心靶点。

图4 交集靶点蛋白互作网络图

2.5 分子对接验证见图5。根据网络中活性成分Degree 值和Cytohubba 分析，采用分子对接分析姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、汉黄芩素和柚皮素与AKT1、TP53 和IL-1β 蛋白间的结合。结果显示，姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、汉黄芩素和柚皮素与AKT1 蛋白稳定结合，结合亲和力分别为-4.1 kJ/mol、-4.8 kJ/mol、-4.0 kJ/mol、-4.5 kJ/mol 和-5.7 kJ/mol；同样，IL-1β 蛋白与姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、汉黄芩素和柚皮素化合物也显示出稳定结合，其结合力分别为-3.3 kJ/mol、-3.1 kJ/mol、-3.4 kJ/mol、-1.4 kJ/mol 和-2.0 kJ/mol；此外，柚皮素与TP53 活性残基的结合力最强，其次是汉黄芩素、山柰酚、姜烯酮A 和槲皮素。

图5核心分子对接模拟图

2.6 各组细胞活性比较见图6A。在无LPS 刺激的条件下，生姜泻心汤提取物浓度在大于100 μg/mL时，能显著降低Caco2 细胞活性（P＜0.05）。见图6B。在LPS（1 μg/mL）刺激下，生姜泻心汤提取物在浓度范围25、50、100 μg/mL 能够显著地抑制LPS刺激引起细胞活性下降（P＜0.05）；而当生姜泻心汤浓度200、400 μg/mL，能显著降低细胞活性（P＜0.05）。

图6 各组细胞活性比较

2.7 各组细胞AKT1、TP53、IL-1β mRNA 表达水平比较见图7。与Ctrl 组比较，LPS 组AKT1、TP53 和IL-1β mRNA 水平均升高（P＜0.05）；与LPS组比较，生姜泻心汤50、100 μg/L 干预后，AKT1、TP53 和IL-1β mRNA 的表达降低（P＜0.05）。

图7 各组细胞AKT1、TP53、IL-1β mRNA 表达水平比较

2.8 各组细胞AKT1、TP53、IL-1β 蛋白表达水平比较见图8。与Ctrl 组比较，LPS 组AKT1、TP53和IL-1β 蛋白表达水平均上调；与LPS 组比较，100 μg/mL 生姜泻心汤干预后，生姜泻心汤组AKT1、TP53 和IL-1β 蛋白表达水平明显下降。

图8 各组细胞AKT1、TP53、IL-1β 蛋白表达水平比较

3 讨论

本研究基于中药复方多成分、多靶点作用的研究思路，应用网络药理学对生姜泻心汤的有效成分进行筛选，结合UC 的发病机制，预测其治疗UC 的关键靶点和信号通路，并对关键靶点进行验证。首先，应用网络药理学构建“复方-药材-活性化合物-靶标-疾病”网络，筛选出生姜泻心汤治疗UC 的有效成分171 种，核心有效成分包括姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、汉黄芩素和柚皮素等。研究中获得生姜泻心汤治疗UC 的可能作用靶点，通过PPI 网络筛选及拓扑分析最终获得HIF1A、STAT3、CTNNB1、CASP3、AKT1、IL-1β、TP53、EGFR、JUN 共9 个核心基因，其中AKT1、IL-1β 和TP53 起关键作用。前期大量的研究也已经证明AKT1、IL-1β 和TP53 基因在UC 发生发展中起关键作用[10-12]。进一步采用分子对接验证结果显示，生姜泻心汤中核心成分和关键靶点的亲和力高，说明生姜泻心汤可能作用于以上靶点（AKT1、IL-1β 和TP53）治疗UC。

为了进一步验证生姜泻心汤可通过调控AKT1、IL-1β 和TP53 靶点治疗UC。本研究采用生姜泻心汤干预LPS 刺激Caco2 细胞模型，结果显示，生姜泻心汤能够剂量依赖性地抑制AKT1、IL-1β 和TP53 mRNA 的表达；同时，免疫荧光分析也同样表明生姜泻心汤能够明显地下调AKT1、IL-1β 和TP53 蛋白的表达，提示生姜泻心汤干预后能够显著地抑制LPS 刺激Caco2 细胞AKT1、IL-1β 和TP53 基因和蛋白的表达，再次证实生姜泻心汤可通过调控AKT1、IL-1β 和TP53 等靶点，改善UC。

综上，本研究以网络药理学预测为基础，通过构建“复方-药材-活性化合物-靶标-疾病”网络，系统地对生姜泻心汤中活性成分进行研究，揭示中药复方与UC 之间的关联性。同时，通过分子对接技术和细胞实验对网络药理学的部分预测结果进行了验证，为深入探究生姜泻心汤的药效物质基础与分子机制提供参考。