子宫内膜容受性检测联用胚胎植入前遗传学检测在反复种植失败患者中的效果研究

袁振亚，袁牧，朱云霞，宋雪梅，林继慧

(徐州市妇幼保健院生殖医学中心,徐州 221009)

反复种植失败(repeated implantation failure,RIF)是人类辅助生殖技术(ART)从业者面临的一大难题,在IVF-ET中的发生率约为10%[1]。多次移植失败不仅会浪费珍贵的胚胎,还会增加患者的心理及经济负担。因此,探究RIF发生的影响因素、改善RIF患者IVF结局成为了当前的研究热点。

子宫内膜对于胚胎的最佳容受时期称为种植窗(window of implantation,WOI)。WOI发生偏移是RIF发生的重要因素之一[1-2]。通过子宫内膜容受性检测(endometrial receptivity testing,ERT)技术对转录组标记物进行下一代测序(next-generation sequencing,NGS),可精确判断RIF患者WOI具体时期,帮助及时调整移植策略,在WOI植入胚胎,可显著改善RIF患者的移植结局[3-4]。2018年中国《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》指出,RIF是胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing,PGT)的重要指征之一[5],应用PGT可显著改善RIF患者的移植结局[6-7]。然而,仍有部分RIF患者接受ERT评估或接受PGT后无法获得成功妊娠。目前,国内尚未见ERT与PGT技术联用的报道。为探究ERT与PGT技术联合应用的效果,本研究对联用ERT与PGT技术的RIF患者的冻融胚胎移植(FET)周期进行了回顾分析,为寻找新的RIF治疗方法提供参考依据。

资料和方法

一、研究对象

本研究选取2018年1月至2023年1月在徐州市妇幼保健院生殖医学中心接受FET的RIF患者。

纳入标准:(1)患者符合本中心RIF的诊断标准(移植3次及以上均失败或移植了高评分卵裂期胚胎数4～6个或高评分囊胚数3个及以上均失败的患者)[5];(2)FET采用激素替代方案进行内膜准备;(3)每个FET周期移植1枚囊胚。

排除标准:(1)前次FET或自然受孕有异位妊娠史;(2)FET前子宫内膜厚度小于7 mm;(3)男方患有严重畸精子症(正常形态精子比例小于1%);(4)男方精子DNA碎片率大于30%;(5)患者宫腔解剖学异常(如粘连、子宫畸形等);(6)患者患有多囊卵巢综合征;(7)患者患有系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病。

共纳入了符合标准的RIF患者的730个FET周期,根据患者接受的评估检测不同分成4组:仅接受PGT的FET周期为PGT组(n=121),仅接受ERT评估的FET周期为ERT组(n=147),接受ERT后移植PGT周期整倍体囊胚的FET周期为联用组(n=138),同期未接受PGT与ERT的FET周期为RIF组(n=324)。

本研究通过了徐州市妇幼保健院生殖医学伦理委员会的伦理审查批准(批件号:[2023]生殖伦审第(01)号)。

二、研究方法

1.ERT评估模型:中南大学湘雅医院和江苏亿康基因科技有限公司合作开发了ERT技术(专利号:201910324707.0),构建了子宫内膜容受期及非容受期的转录组模型。采集受试者的子宫内膜样本,提取mRNA进行高通量测序,获得受试者的子宫内膜转录组数据代入模型进行分析,可精准地判断受试者的WOI是否发生偏移,并推算出具体的WOI。

2.激素替代方案(HRT)及内膜准备:月经第2天,全部患者使用长效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a,珠海丽珠)3.75 mg/次 1次/d,使用28 d后开始雌二醇(雅培,荷兰)4～6 mg/d连用14 d。当内膜厚度达到7.5 mm及以上时,全部患者使用90 mg/d黄体酮阴道缓释凝胶(默克雪兰诺,英国)、10 mg地屈孕酮(达芙通;雅培,荷兰)每日口服2次,共转化5 d。转化第6天PGT组和RIF组停用黄体酮和地屈孕酮进行FET;ERT组和联用组停用黄体酮和地屈孕酮,接受ERT评估,在有明确ERT评估结果后,ERT组和联用组再次进行HRT,根据ERT结果调整使用黄体酮和地屈孕酮的转化时长后再行FET。

3.ERT评估:在ERT组、联用组患者黄体酮转化第6天使用一次性子宫内膜样本采样器(苏州序康医疗科技)伸入宫腔抽吸约3 mm大小的活检样本,推入RNA样本保存液(苏州序康医疗科技)4℃保存;使用RNeasy Micro Kit试剂盒(Qiagen,德国)进行mRNA提取,使用MALBAC白金微量 RNA 扩增试剂盒(苏州亿康基因科技)进行RNA扩增,使用NGS 通用 Index 试剂盒(Illumina,美国)和Miseq基因测序仪(Illumina,美国)进行mRNA测序;将测序结果代入子宫内膜容受期模型,推算患者WOI,调整FET时间。PGT组、RIF组不进行此步骤。

4.囊胚PGT:对PGT组和联用组第5、6天的囊胚外滋养层细胞进行活检,对活检产物使用胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒(北京中仪康卫)进行全基因组扩增,使用 Illumina Miseq测序平台(Illumina,美国)进行NGS。数据下机后完成测序质控,进行生物信息学分析,获得受检囊胚遗传学检测信息,筛选整倍体囊胚进行FET。ERT组、RIF组不进行此步骤。

5.囊胚移植:在黄体酮转化第6天,对RIF组实施囊胚移植;根据ERT评估结果调整移植时间,在WOI内对ERT组实施囊胚移植;筛选整倍体囊胚,根据ERT评估结果调整移植时间,在WOI内对联用组实施囊胚移植;筛选整倍体囊胚,对PGT组实施囊胚移植。

三、观察指标

各组患者基础资料,包括女方年龄、男方年龄、不孕年限、不育年限、体质量指数(BMI)、基础激素水平;FET相关资料,包括移植日内膜厚度、胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%、HCG阳性率=HCG阳性FET周期数/FET周期数×100%、宫内妊娠率=宫内妊娠FET周期数/FET周期数×100%、异位妊娠率=异位妊娠FET周期数/FET周期数×100%、流产率=流产FET周期数/获宫内妊娠FET周期数×100%、活产率=活产分娩周期数/FET周期数×100%;ERT组患者WOI偏移率=ERT组WOI偏移患者数/ERT组患者数×100%;联用组患者WOI偏移率=联用组WOI偏移患者数/联用组患者数×100%;接受ERT评估的患者WOI偏移率(ERT组与联用组WOI偏移患者数/ERT组与联用组患者数×100%)。

四、统计学处理

结 果

一、患者一般资料

本研究共纳入了符合标准的患者的730个FET周期,其中PGT组121周期(n=121),ERT组147周期(n=147),联用组138周期(n=138),RIF组324周期(n=324)。

患者一般资料的分析结果显示,各组间的女方年龄、男方年龄、不孕年限、不育年限、BMI、基础激素水平[卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、泌乳素(PRL)及黄体生成素(LH)]均无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般资料[(-±s),M(P25,P75)]

二、ERT组和联用组的ERT评估结果

接受ERT评估的ERT组和联用组共285个周期,其中273个周期出现了WOI后移,即在常规内膜准备情况下,按月经周期推算出的最佳移植时期实际为容受前期,实际的WOI较常规WOI推后1～2 d,接受ERT评估的患者WOI偏移率达到了95.79%(273/285)。ERT组WOI偏移率达到了96.60%(142/147);联用组WOI偏移率达到了94.93%(131/138)。

三、各组FET周期临床结局比较

PGT组、ERT组、联用组和RIF组移植优质囊胚占比分别为89.26%(108/121)、85.71%(126/147)、87.68%(121/138)和83.95%(272/324),组间无显著差异(P>0.05)。各组移植当日的内膜厚度、异位妊娠率、流产率也均无显著差异(P>0.05)(表2)。

表2 患者FET周期结局[(-±s),%]

联用组的胚胎种植率、宫内妊娠率、活产率均显著高于其余3组(P<0.05);联用组的HCG阳性率显著高于PGT组与RIF组(P<0.05),虽高于ERT组,但差异尚无统计学意义(P>0.05);PGT组的胚胎种植率、HCG阳性率、宫内妊娠率均显著高于RIF组(P<0.05);PGT组的活产率高于RIF组,但差异尚无统计学意义(P>0.05);ERT组的HCG阳性率、宫内妊娠率均显著高于RIF组(P<0.05);ERT组的胚胎种植率、活产率均高于RIF组,但差异尚无统计学意义(P>0.05);ERT组与PGT组的胚胎种植率、HCG阳性率、宫内妊娠率、活产率均无显著差异(P>0.05)(表2)。

四、RIF患者活产的影响因素

Spearman相关分析显示,RIF患者FET后获得活产与实施PGT、接受ERT、接受优质囊胚移植显著正相关(P<0.05);与女方年龄、男方年龄显著负相关(P<0.05);与不孕类型(原发不孕/继发不孕)、不育类型(原发不育/继发不育)、不孕年限、不育年限、BMI、FSH、E2、P、PRL、LH、移植当日内膜厚度、冷冻日囊胚发育天数(D5/D6)、受精方式(ICSI/IVF)、囊胚D3卵裂球数的相关性不显著(P>0.05)。以“获得活产”作为因变量,“实施PGT”、“接受ERT”、“接受优质囊胚移植”、“女方年龄”、“男方年龄”5个变量为协变量,进行Logistic回归分析,结果表明:实施PGT、接受ERT、接受优质囊胚移植、女方年龄4个变量是获得活产的独立影响因素(P<0.05)(表3)。其中“实施PGT”的校正后OR=1.975,说明接受PGT后移植整倍体囊胚获得活产的概率是不接受PGT的1.975倍;“接受ERT”的校正后OR=1.711,说明接受ERT评估后在WOI移植获得活产的概率是不接受ERT的1.711倍;“接受优质囊胚移植”的校正后OR=1.677,说明选择优质囊胚进行FET获得活产的概率是选择非优质囊胚的1.677倍;“女方年龄”的校正后OR=0.941<1,说明女方年龄越大,获得活产的概率越低(表3)。

表3 影响活产的多因素Logistic回归分析

讨 论

从目前的研究结果来看,导致RIF的原因主要有胚胎因素与子宫内膜容受性因素。PGT技术提供了有力的胚胎学支持,让RIF的诊断不仅依靠临床假设[8]。ERT技术的出现则首次从分子生物学角度阐述了RIF发生的可能机制,并开辟了临床治疗RIF的新途径[1,3]。应用PGT技术帮助筛选整倍体胚胎,或经ERT评估后在WOI内完成胚胎移植,均可改善RIF患者的FET结局[3,6]。然而,仍有一部分RIF患者通过PGT移植整倍体胚胎或在WOI内接受胚胎移植未获成功妊娠和活产,这说明对于同一个RIF患者,胚胎染色体异常和子宫内膜容受性不佳两种因素可能同时存在,且可能还有更多未被阐明的影响RIF成功率的因素。为探究这些患者生育问题的解决方法,我们分析比较了联用ERT与PGT、单独接受ERT和单独应用PGT的RIF患者的FET结局。研究结果证明,联用ERT与PGT是治疗RIF的一次成功尝试。经过ERT评估后,在WOI内移植整倍体囊胚,可进一步显著改善RIF患者的FET结局。

探究RIF治疗方法的最终目的是使RIF患者获得活产。女方年龄、接受ERT、实施PGT、囊胚质量是影响RIF患者活产率的4个重要因素。在未进行PGT的情况下,筛选优质胚胎用于移植是提高RIF患者成功率的关键之一。相比形态学表现欠佳的胚胎,优质胚胎具有更高的整倍体率、更好的发育潜能[9]。在母胎界面,囊胚需要先脱出透明带才能完成在子宫内膜种植的过程。FET的过程需要让胚胎经历冷冻和冻融的操作,可能会导致透明带硬化影响囊胚孵出,导致种植失败。优质囊胚具有很强的抗逆能力,可在冻融后快速复苏扩张,降低透明带硬化对胚胎种植的影响[10]。

本研究发现,在仅接受PGT和PGT、ERT均未接受的两类RIF患者中,未获活产患者的女方年龄均显著高于获得活产患者(P<0.05),且获得活产患者移植优质囊胚占比均显著高于未获活产(P<0.05),提示女方患者年龄、囊胚质量可能是影响活产的重要因素,且即便是整倍体囊胚,优质的囊胚可能具有更佳的发育潜能;然而,在仅接受ERT和同时接受PGT与ERT的两类RIF患者中,获得活产者与未获活产者的女方年龄、移植优质囊胚占比均没有显著差异(P>0.05),提示可能还有其它原因影响RIF患者的活产率。

本研究中接受ERT评估的RIF患者WOI偏移率达到了95.79%,与本中心前期研究持平,显著高于其他研究的WOI偏移率(P<0.05),这可能与严格根据指征筛选受试者有关[1,3]。外源激素可影响子宫内膜多个基因的表达,因此,人工激素内膜准备的用药方案不同,也可能导致ERT评估WOI偏移率出现差异[1]。

本研究共纳入RIF患者730个FET周期,分为了4个研究组,每组的样本量、患者选择具有一定局限性。虽然在IVF中RIF的发生率约为10%,但其中一部分患者伴有子宫内膜厚度不够、宫腔解剖学异常、男方精子异常等会明显影响种植率或胚胎质量的因素,这些患者的FET周期在本研究中需要被剔除;本研究各组患者女性平均年龄<34岁,IVF结局较好,但高龄、胚胎质量差、无法在IVF中获得囊胚的RIF患者的FET周期则无法被纳入本研究,而以上患者虽然在RIF患者群体中占比不高,却是ART治疗的一大难点。因此,需要更多、更深入的研究来开发这部分患者的RIF治疗方法。

除胚胎整倍性与子宫内膜WOI以外,胚胎种植成功率也受多种因素的影响。子宫内膜母胎界面的免疫异常被认为会干扰胚胎种植,可能为导致RIF的原因之一[8,11-13];子宫内膜的血流灌注状态也与内膜容受性相关,从而影响胚胎种植[14];细胞调控因子(包括microRNA、lncRNA、circular RNA等)广泛参与了子宫内膜容受性相关的基因表达、信号转导与相互作用的调控,对胚胎的成功种植具有重要意义[15-16]。针对以上因素,研究人员尝试了一系列临床应对措施,包括应用低分子肝素改善母体高凝状态;对免疫过度活跃患者应用免疫抑制剂,如外源糖皮质激素纠正辅助性T细胞1/辅助性T细胞2的异常、环孢素A抑制效应T细胞激活等;对免疫不活跃患者进行内膜机械刺激改善血流状态;宫腔灌注改善胚胎粘附环境等,改善了RIF患者的移植结局[8]。此外,多种细胞调控因子被认为是反映子宫内膜容受性的分子标志物,在未来具有被应用于临床判断子宫内膜容受状态的重要价值[17]。

在国外,PGT技术被认为可以有效改善RIF患者移植结局,而子宫内膜容受性分析(endometrial receptivity analysis,ERA)技术、联用ERA和PGT技术对RIF患者的临床应用效果存在争议[18-20]。目前来看,ERT技术在国内RIF患者中的应用效果良好,PGT技术能够改善RIF患者FET结局的观念也被广泛认可[3,5-7]。本研究结果证明,联用ERT与PGT技术,可在PGT或ERT应用的基础上,进一步显著提升RIF患者FET的胚胎种植率、宫内妊娠率与活产率,为寻找新的RIF治疗方法提供了依据,但此联用技术在高龄、胚胎质量差或IVF仅有卵裂期胚胎的RIF患者中应用效果仍需更多分析和研究。