Top-down控制图法评定石墨炉原子吸收光谱法测定血中铅含量的不确定度

2024-03-19丁建东宁攀良

化学分析计量 2024年2期

丁建东，宁攀良

（1.广西壮族自治区药品检验研究院，南宁 530021； 2.广西壮族自治区职业病研究院，南宁 530021）

重金属元素铅广泛存在于食物链和生活环境中，其主要通过呼吸道和消化道进入人体并蓄积于人体组织中。当蓄积于人体组织的铅积累到一定程度后会对机体的神经、血液、消化系统产生损害。血铅含量可以直接反映人体内铅水平的高低，从而被用于人群铅暴露水平的生物监测和慢/急性铅中毒病人的诊断[1-4]。

血铅是国家职业卫生标准GBZ 37—2015《职业性慢性铅中毒的诊断》的实验室检测指标，准确可靠的分析结果对职业病的诊断非常重要。不确定度的大小直接关系到测定结果的可信程度，因此需要对检测方法进行不确定评定。不确定度评定方法有GUM法和Top-down法两种。GUM法是一种“自下而上”的方法，通过考察所有可能影响测量结果准确性的不确定分量，并计算得到合成不确定度，计算过程复杂，适合于短期样品或复检样品，对评定人员要求较高。目前血铅含量的不确定度评定都采用该方法[5-9]。Top-down 法是一种“自上而下”的方法，通过对一段时期内质控样品的检测数据进行离群值、正态性、独立性统计验证分析，证实实验室测量系统统计可控的假设，并直接进行测量不确定的评定，非常适合于日常监测项目。近年来，Top-down方法已广泛应用于环境、食品、药品等领域检测方法测定不确定度的评估[10-15]。

笔者参照国家卫生行业标准GBZ/T 316.1—2018《血中铅的测定第1部分：石墨炉原子吸收光谱法》对血中的铅进行检测，采用Top-down 控制图法对血铅检测结果进行不确定度评定，旨在加强实验室内部质量控制，监控实验室检验结果有效性，观察和分析异常趋势，及时发现问题并进行改进，为实验室进行不确定度评定提供借鉴。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

原子吸收分光光度计：ⅠCE3500型，美国赛默飞世尔科技有限公司。

铅单元素标准溶液：100 μg/mL，标准物质编号为GBW 08619 (17113)，中国计量科学研究院。

硝酸：分析纯，西陇化工股份有限公司。

曲拉通(TritonX-100)：化学纯，国药集团化学试剂有限公司。

冻干牛血铅、镉成分分析标准物质：铅的质量浓度标准值为(104±15) μg/L，标准物质编号为GBW 09139，批号为2020001，中国疾病预防控制中心。

1.2 仪器工作条件

光源：铅灯，塞曼扣除背景；分析波长：283.3 nm；狭缝：0.7 nm；进样体积：10 μL；定量方法：吸光光谱峰高法。石墨炉的测定条件见表1。

表1 石墨炉测定条件Tab.1 Determination conditions of graphite furnace

1.3 实验步骤

1.3.1 样品及样品空白预处理

样品预处理方法：将冷冻血样取出，恢复到室温，充分振摇混匀。于1.5 mL石墨炉样品杯中加入1 000 μL 稀释液，取出50 μL 摇匀后的血样加入稀释液中充分混匀，作为样品溶液。

样品空白预处理方法：用采血针抽取2.0 mL水置于采血管中，振荡，其余处理步骤同上。

1.3.2 定量方法

血铅系列标准工作溶液的测定：将铅单元素标准溶液用0.4%(体积分数，下同)曲拉通溶液释成50.0 μg/L 标准使用液，以0.4%曲拉通溶液作为标准空白，利用石墨炉原子吸收仪的自动进样器，将正常人血匹配基体自动稀释成质量浓度分别为0.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/L 的系列标准工作溶液，按1.2 仪器工作条件分别测定，以吸光度峰高为纵坐标，溶液质量浓度为横坐标计算回归方程(仪器自动将标准加入法转换成外标法)。

样品及空白样品的测定：按1.2仪器工作条件测定样品及空白样品，空白测定结果应小于检出限。

2 结果与讨论

2.1 质控样品铅含量测定结果

冻干牛血质控样品(GBW 09139)使用时加2.00 mL纯水，放置60 min后，加盖摇匀。与日常采集的检测血样一样放置，按照1.3实验方法，在1.2仪器工作条件下进行检测。每周进行一次质控样中铅含量的检测，连续测定35周，测定结果见表2。

表2 血质控样中铅质量浓度测定结果Tab.2 Determination results of lead mass concentration in blood quality control samples

在期间精密度条件下，指数加权移动平均值(E)按式(1)、式(2)计算，移动极差(R)、期间精密度标准差(sR')分别按式(3)、(4)计算。

式中：Ei——指数加权移动平均值，μg/L；

i——时序，i=1，2，3，…，n（n为测量次数）；

λ——权值，λ=0.4；

ρi——质控样中铅质量浓度，μg/L；

Ri——移动极差，μg/L；

Rˉ——Ri的均值；

sR'——期间精密度标准差，μg/L。

采用Excel 平均值函数和标准偏差函数计算得冻干牛血质控样品中铅平均质量浓度ρˉ=105.97 μg/L，标准偏差s=6.20 μg/L。按式(3)和(4)分别计算，平均移动极差Rˉ=6.79 μg/L，期间精密度标准差sR'=6.02 μg/L。

2.2 离群值检验

用格拉布斯检验(G检验)法对35组检测数据进行离群值检验，格拉布斯统计量G按式(5)计算：

其中，ρmin=94.80 μg/L，ρmax=117.88 μg/L，经计算：Gmin=1.80，Gmax=1.92。查阅格拉布斯(G)临界表，G0.05，35=2.811，Gmin＜G0.05，35，Gmax＜G0.05，35，表明检验显著水平α=0.05时，35组数据无离群值。

2.3 正态性和独立性检验

参照GB/T 141—2018《化学检测领域测量不确定度评定利用质量控制和方法确认数据评定不确定度》，用Anderson-Darling检验(AD检验)对表2中的数值进行正态分布和独立性检验。结果见表3。

表3 血质控样中铅含量AD统计结果Tab.3 AD test data of lead content in blood quality control samples

非离群测量结果ρi按升序排列后，其标准化值ωi按式(6)计算[16]。ωi(s)、pi(s)、Ai(s)、ωi(R)、pi(R)、Ai(R)的计算结果见表3。然后按式(7)～式(9)，给出按贝塞尔公式(s式)或移动极差公式(R式)计算正态性检验统计量A2(s)、A2*(s)和独立性检验统计量A2(R)、A2*(R)，得到：A2(s)=0.457，A2*(s)=0.467，A2(R)=0.530，A2*(R)=0.543。A2*(s)＜0.752，A2*(R)＜0.752，表明35 组测量结果在95%置信概率下的正态性和独立性假设是可接受的。

式中：ωi——ρi的标准化值；

ρˉ——ρi的平均值；

sρi——分别按贝塞尔公式(s式)或移动极差公式(R式)计算的ρi标准差，其中Ri按照公式(3)计算；

A2*——A2的修正值；

pi——正态概率值。

2.4 建立质量控制图

2.4.1 测量结果ρi的控制图

根据2.1 结果，测量结果ρi的中心线ρˉ=105.97 μg/L、上行动限Uρ=ρˉ+2.66Rˉ=124.03 μg/L、下行动限Lρ=ρˉ-2.66R=87.91 μg/L。以测定次序为横坐标，测量结果ρi为纵坐标，绘制测量结果控制图，见图1。

图1 测试结果平均值图与Ei叠加图Fig.1 Test results average figure and EWMA overlay figure

2.4.2 指数加权平均移动值控制图

根据2.1 结果，测量结果ρi的中心线ρˉ=105.91 μg/L，指数加权移动平均值Ei的上行动限UE=ρˉ+3sR'(λ/2-λ)1/2=114.94 μg/L和下行动限LE=ρˉ-3sR'(λ/2-λ)1/2=96.88 μg/L，以指数加权移动平均值Ei为纵坐标，测定次数为横坐标，绘制指数加权平均移动值控制图，见图1。

2.4.3 移动极差R图

根据2.1 结果，测量结果ρi的中心线Rˉ=6.79 μg/L、移动极差的(R)的上行动限UR=3.27Rˉ=22.20 μg/L。以移动极差(R)为纵坐标，测定时序为横坐标，绘制移动极差控制图，见图2。

图2 移动极差图Fig.2 Moving range diagram

2.4.4 控制图分析

将ρi、Ei、Ri数据按照GB/T 27411—2012 进行统计分析，结果表明，各控制数据均处于各自行动限内，且未发现趋势现象，说明测量系统误差来源于随机误差。

2.5 偏倚估计的t检验

使用铅质量浓度定值为104 μg/L 冻干牛血作为检测质控样。按照公式(10)、(11)用t检验对整个测量系统进行偏倚估计：

式中：t——标准方程检验统计量；

μ0——质控样中铅理论质量浓度，μ0=104 μg/L；

tR——期间精密度标准差检验统计量。

通过计算，t=1.880，tR=1.936。查GB/T 4882—2001中t检验临界表，在95%置信概率下，t分布双侧情形下，t0.05，34=2.032。t、tR都小于t0.05，34，表明测量过程的偏倚可以忽略。

2.6 不确定度的评定

综上，冻干牛血质控样品中铅含量测定结果在偏倚受控的期间精密度条件下进行。根据GB/T 27411—2012，实验室根据实际情况，以期间精密度标准差作为合成不确定度uc，选择扩展因子k=2 合成扩展不确定度U。即：石墨炉原子吸收光度法检测冻干牛血质控样品中铅含量的扩展不确定度U=k×uc=2×uc=2×sR'=12.04 μg/L (包含因子k=2)，因此冻干牛血质控样品中铅的质量浓度为93.93～118.01 μg/L (k=2)，而冻干牛血质控样品中铅质量浓度标称值为(104±15) μg/L，即冻干牛血质控样品中铅质量浓度标称值为89～119 μg/L。可认为用Top-down控制图法计算得到的不确定度与定值所赋予的不确定度结果基本一致，表明用该方法评定不确定度所得到的结果是准确可靠。