基于磁性分子印迹技术检测食品中利巴韦林含量

金文丽，周鑫魁，李建民，张连钢，张婧蕾，袁嘉男

1.嘉峪关市食品药品和医疗器械检验检测中心 （嘉峪关 735100）；2.甘肃省商业科技研究所有限公司 （兰州730010）

利巴韦林为白色结晶性粉末，无臭。易溶于水[1-2]。被用于治疗病毒性引起的肝炎，腮腺炎，肺炎[3]。利巴韦林服用之后会引起神经系统反应，比如眩晕，还会导致消化系统反应，出现恶心、消化不良等症状[4]。违法商家会将其添加在殖饲料中，减少养殖过程病毒的侵害[5]。消费者会购买并食用带有抗生素的肉制品，从而对人体健康产生潜在性的危害。国家标准规定肉及肉制品中不得检出利巴韦林[6]。利巴韦林的检测，需要经过酸化提取，硼酸固相萃取柱净化，液相色谱质谱联用仪检测。在实际检测试验中，实验操作要求极高，微小的偏差都会影响利巴韦林的检测结果[7-8]。所以建立一种准确性高、稳定性好、易操作的检测方法是有必要的。

分子印迹是通过印迹分子与模板分子之间通过π键和非共价键结合。生成的印迹聚合物[9-10]。分子印迹微球技术，将聚合物微球经过研磨，得到粒径均一的分子印迹吸附材料[11]。可用于固相萃取过程中。本研究旨在利用自主合成磁性分子印迹材料[12]，建立一种稳定性良好的快速，高效，准确，易操作的利巴韦林检测方法。现有报到中，很少由关于磁性分子印迹材料用于食品中利巴韦林的检测的实验。研究也为利巴韦林检测方法提供新的思路，为磁性分子印迹拓宽应用领域打好基础。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

7307振动样品磁强计（美国Lake Shore公司）；H-800透射电镜（日本日立公司）；岛津20A液相色谱仪（日本岛津科技有限公司）；IRSpirit红外光谱仪（日本岛津科技有限公司）。

利巴韦林（化学纯，南京都莱生物技术有限公司）；氯化铁，分析纯、氯化亚铁（分析纯，天津市百世化工有限公司）；α-甲基丙烯酸（MAA，分析纯，阿拉丁试剂上海有限公司）；三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM，分析纯，阿拉丁试剂上海有限公司）；偶氮二）；硅烷偶联剂KH570（MPS，分析纯，阿拉丁试剂上海有限公司）；甲苯（分析纯，天津市化学试剂公司）；正硅酸乙酯（TEOS，分析纯、天津光复科技发展有限公司）；聚乙烯醇2000（分析纯、天津光复科技发展有限公司）；盐酸（分析纯、天津光复科技发展有限公司）；甲醇（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）；乙腈（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）；去离子水（用优普超纯水制备仪制备）；肉及肉制品样品（购于超市及农贸市场）。

1.2 方法

1.2.1 Fe3O4磁性化合物制备

参考文献[13]方法，利用共沉淀法制备磁性Fe3O4。称取4.7 g氯化铁和1.9 g氯化亚铁于300 mL球形，可加热，耐压反应釜中。加入120 mL去离子水，通入氮气20 min，加入10.5 mL氨水，继续通入20 min氮气，密封反应釜。将反应釜加热至内部温度105 ℃，反应1 h。反应结束，冷却至常温，用强磁计在反应釜外部吸附生成的Fe3O4磁性化合物，将上层反应残留液倾倒出反应釜，并反复加入去离子水洗涤Fe3O4磁性化合物，直至洗涤液变为中性。收集Fe3O4磁性化合物与干燥皿中，于60 ℃真空干燥6 h。得到黑色粉末即为Fe3O4磁性化合物。

1.2.2 含Fe3O4磁性化合物聚合单体制备

参考文献[14]方法，以TEOS为硅源，碱催化溶胶-凝胶法，制备Fe3O4磁性化合物聚合单体。称取1.0 g 1.2.1小节中制备的Fe3O4磁性化合物于500 mL磨口三角瓶中，加入200 mL乙醇，超声使Fe3O4磁性化合物分散于乙醇中。快速搅拌并依次快速加入3 mL去离子水、8 mL氨水和9 mL TEOS，迅速盖紧瓶盖。于电磁搅拌加热器上，转速300 r/min于，70 ℃反应5 h。用强磁计在三角瓶外部吸附生成产物，倾倒出全部上层残留液体，并反复加入去离子水洗涤产物，直至洗涤液变为中性。向瓶中加入200 mL乙醇，超声使其分散。快速搅拌并加入12 mL MPS，在温度40 ℃、转速300 r/min条件下搅拌反应8 h，反应产物经外磁场分离，并用去离子水多次洗涤。最后，将产物于60 ℃真空干燥6 h。得到黑色粉末，即为Fe3O4磁性化合物聚合单体。

1.2.3 利巴韦林磁性分子印迹微球（MMIPs）制备

参考文献[15]方法。在三口反应瓶中加入0.32 g利巴韦林，0.1 g AIBN，0.02 g聚乙烯醇和120 mL去离子水。充入20 min氮气，搅拌下升温至65 ℃使其完全溶解。加入0.2 g 1.2.2小节中制备的Fe3O4磁性化合物聚合单体，持续通入氮气，以1滴/3 s的滴速由加液漏斗滴加0.45 mL MAA和14.0 mL TRIM，10.0 mL苯的混合溶液，滴加结束后，持续通氮气，搅拌下升温至70 ℃反应7 h。聚合反应结束后将得到的聚合物微球滤出，依次用蒸馏水、甲醇、丙酮各100 mL洗涤。除去洗掉苯、剩余的有机单体等，按甲醇-乙酸体积比70∶30索氏抽提48 h，洗去分子模板，用去离子水将分子印迹清洗干净。直至清洗液液用紫外检测不到模板分子，在50 ℃下真空干燥24 h，放入干燥器备用。磁性非分子印迹微球（MNIPs）的制备与MMIPs相同，但不加入利巴韦林。

1.2.4 利巴韦林液相色谱检测条件

色谱条件：a）色谱柱4.6×150 mm，C18键合填料色谱柱；b）流动相为50 mmol/mL的pH 4.0乙酸铵缓冲液+乙腈；c）流速为1 mL/min；d）柱温为30 ℃；e）进样量为20 μL；f）波长为230 nm。

1.2.5 利巴韦林MMIPs和MNIPs吸附容量测定

分别称取7份0.01 g MMIPs和MNIPs置于10 mL离心管中，7支离心管中分别加入5.00 mL不同质量浓度的利巴韦林乙腈溶液，其质量浓度分别为1，2，5，10，20，30和50 μg/mL。在常温下涡旋振荡1 min，用强磁计操作进行利巴韦林MMIPs和MNIPs与溶液分离，并通过液相色谱检测残留乙腈溶液中利巴韦林的含量。按式（1）计算MMIPs和MNIPs对利巴韦林的吸附容量。并绘制静态吸附等温线。

式中：Q为吸附容量，mg/kg；C初始为吸附前利巴韦林初始质量浓度，μg/mL；C残留为吸附后利巴韦林残留质量浓度，μg/mL；V为溶液体积，mL；m为MMIPs和MNIPs的使用质量，g。

分别称取7份0.01 g MMIPs和MNIPs置于10 mL离心管中，7支离心管中分别加入5.00 mL质量浓度为30 μg/mL的利巴韦林乙腈溶液。在常温下，分别涡旋振荡10 s，20 s，30 s，45 s，1 min，2 min和5 min，用强磁计操作进行利巴韦林MMIPs和MNIPs与溶液分离，并通过液相色谱检测，残留乙腈溶液中利巴韦林的含量。按式（1）计算MMIPs和MNIPs对利巴韦林的吸附容量。并绘制吸附动力学曲线。

1.2.6 利巴韦林MMIPs专一性验证

利巴韦林结构为1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酰胺，现将利巴韦林，阿昔洛韦，青霉素，四环素等抗菌或抗病毒药物混合，配制成溶液。其质量浓度分别为利巴韦林10 μg/mL，阿昔洛韦10 μg/mL，青霉素10 μg/mL，四环素10 μg/mL。分别称取4份0.01 g MMIPs置于盛有上述溶液的10 mL离心管中，在常温下，涡旋振荡1 min，用强磁计操作进行利巴韦林MMIPs与溶液分离，并通过液相色谱检测残留溶液中利巴韦林的含量。并参考文献[18]方法检测残留阿昔洛韦的含量，参考文献[19]方法检测残留青霉素的含量，参考文献[20]方法检测残留四环素的含量。

1.2.7 MMIPs对利巴韦林的吸附pH条件

在不同pH环境下，分子印迹对目标物质利巴韦林的吸附性质也有所不同。分别用pH为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0的乙腈缓冲液，配制10 μg/mL的利巴韦林溶液。分别取上述溶液5.00 mL于10 mL离心管中。按照1.2.5小节处理，并进入高效液相色谱仪测定利巴韦林的含量。

1.2.8 利巴韦林溶液中溶剂对吸附效果的影响

目标物被吸附在MMIPs上，可以用甲醇、甲醇-水溶液、纯水将其从分子印迹上洗脱下来，所以上样溶液不能是含纯甲醇或者含水的溶液。一定要选择合理的溶液比例，确保MMIPs对目标物达到最佳吸附条件。选择体积乙腈体积分数为0，5%，10%，15%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%和100%的乙腈-水溶液，配制10 μg/mL的利巴韦林标准溶液。分别取上述溶液5.00 mL于10 mL离心管中。按1.2.5小节处理，并进入高效液相色谱仪测定残留液中利巴韦林的含量，用强磁计操作进行利巴韦林MMIPs与溶液分离，用5 mL去离子水洗涤MMIPs，收集全部洗涤液，进入液相色谱检测。

1.2.9 固相分散萃取填料的制备

称取30 g MMIPs，45 g PSA，45 g C18和60 g无水硫酸钠，混合后，于均质机中均质混匀。得到灰黑色固相分散萃取填料。

1.2.10 样品前处理

肉及肉制品一般为固体。其中含有大量蛋白质、油脂等杂质，会对液相色谱、液相质谱检测结果造成影响。需要建立一种方法，既能有效地从样品中提取目标物利巴韦林，又能减少杂质的影响。由于利巴韦林易溶于水、较易溶于甲醇、乙腈，所以可以用乙腈直接提取经分子印迹固相萃取填料净化富集，用水洗脱，进行检测。

称取5.00 g粉碎后的样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈提取，乙腈可以使样品蛋白质变性沉淀。涡旋2 min后，加入2 g无水硫酸钠，涡旋振荡1 min后，在2 000 r/min条件下离心2 min。取全部上清液于新的50 mL离心管中，加入1.0 g固相分散萃取填料，涡旋振荡1 min，用强磁计操作进行利巴韦林MMIPs于溶液分离。用1 mL乙腈洗涤离心管底部黑色固体粉末，弃去乙腈，用1 mL去离子水洗涤离心管底部黑色固体粉末，收集全部洗涤液，经过0.22 μm滤膜后，进入液相色谱检测。并验证实际样品检测中的回收率，精密度，检出限，线性范围。

2 结果与讨论

2.1 表征

2.1.1 MMIPs电镜表征

由图1可知，所制备的MMIPs呈球形，微球平均粒径为2.5 μm。从电镜图中可以看出，微球粒径均匀，且没有其他不规则形状。说明制备的材料单分散性良好。材料具有单分散性，有利于后续实验中目标物的吸附和解析。同样增加材料的使用稳定性。材料中加入Fe3O4磁性化合物聚合单体，该单体中有SiO2，增加材料刚性。后续实验中该材料在离心，涡旋，超声条件下仍保持良好的机械强度，确保吸附性能的稳定。

图1 MMIPs透射电镜图

2.1.2 MMIPs红外表征

由图2可知，Fe3O4磁性化合物聚合单体，915 cm-1处为聚合物单体的环氧基伸缩振动吸收峰，1 097 cm-1处出现的谱带为SiO2的不对称伸缩振动吸收，1 635 cm-1为C＝C的伸缩振动峰。经聚合反应，得到MMIPs微球，C＝C参与反应，该处吸收峰消失。2 920 cm-1和2 850 cm-1处出现了—CH2—的不对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰，说明发生了聚合反应。

图2 MMIPs红外光谱图

2.2 利巴韦林液相色谱图

由图3可知，利巴韦林在2.248 min出现特征色谱峰，峰型良好，没有严重的前延和拖尾现象，周围没有杂质峰影响定量积分。证明建立的样品前处理条件能达到净化目的，色谱条件能达到分离定量及定性的目的。

图3 利巴韦林标准及样品色谱图

2.3 利巴韦林MMIPs和MNIPs吸附容量

以MMIPs和MNIPs对利巴韦林的吸附容量为纵坐标，吸附母液浓度为横坐标，绘制的静态吸附等温线如图4（a）所示。以MMIPs和MNIPs对利巴韦林的吸附容量为纵坐标，吸附时间为横坐标，并绘制吸附动力学曲线如图4（b）所示。

图4 MMIPs和MNIPs对利巴韦林的吸附等温线（a）和吸附动力学曲线（b）

由图4（a）可知，MMIPs的吸附容量随利巴韦林浓度增加而增大，但是当目标物质量浓度超过10 μg/mL时，吸附容量增大趋势缓慢，当吸附容量超过5 835 μg/g时，达到最大吸附容量，随利巴韦林浓度增加，吸附容量几乎不变。是因为MMIPs在制备过程中形成的有效吸附点位的数量有限，无法无限制的吸附目标物。由图4（b）可知，当吸附时间的增加，吸附容量也随之增大，在涡旋振荡1 min内达到吸附平衡，继续增加吸附时间，吸附容量几乎不增大。此处可以看出本研究制备的MMIPs能在极短的时间内完成对目标物的吸附。较文献[20]中报到的40 min达到吸附平衡，极大的提高了吸附效率。这是因为MMIPs微球，在制备过程中形成的2 μm多孔单分散微球，微球比表面积大，与目标物作用速度快。这也为后续检测方法的建立奠定基础。而MNIPs对利巴韦林的几乎不产生吸附效果。也说明MMIPs的制备是成功的。

2.4 利巴韦林MMIPs专一性

MMIPs对利巴韦林，阿昔洛韦，青霉素，四环素的吸附容量如表1所示。由表1可知，MMIPs对利巴韦林吸附效率大于95%，10 μg/mL质量浓度下吸附容量为4 975 mg/kg。而MMIPs阿昔洛韦、青霉素、四环素的吸附效率不超过2%，吸附容量不超过65 μg/g，可以认为MMIPs专一性良好，对利巴韦林以外的药物几乎不产生吸附效果，这是因为试验中四种药物虽然都是抗菌抗病毒的药物，结构也有一定程度上的相似性，但是分子大小和空间结构，仍然存在很大差异，与MMIPs吸附位点不完全匹配，所以其他分子的吸附容量很低。

2.5 MMIPs对利巴韦林的吸附pH条件

以pH为横坐标，残留液中利巴韦林浓度为纵坐标，得到不同pH对MMIPs吸附利巴韦林的影响趋势图，如图5所示。

图5 溶液pH对吸附效果的影响

由图5可知，当pH＜6或者pH＞8时，分子印迹对利巴韦林的吸附有明显下降趋势。而在6≤pH≤8范围内，分子印迹对利巴韦林的吸附并不受pH影响。所以前处理使用乙腈提取，保持提取液，上样液均为中性，满足pH要求。

2.6 利巴韦林溶液中溶剂对吸附效果的影响

以溶液中乙腈含量为横坐标，残留液和洗脱液中利巴韦林的含量为纵坐标绘制曲线图，得到溶剂对MMIPs吸附和洗脱效果的影响趋势，如图6所示。

图6 溶液中乙腈含量对吸附和解析效果的影响

由图6可知，当水含量越大时，测得利巴韦林最终含量逐渐减小，而残留液中目标物含量逐渐增加。说明，当溶液中水含量增加时，MMIPs对目标物的吸附能力减弱，目标物仍然留在溶液中，影响最终检测结果。当溶液为纯乙腈时，MMIPs可以有效的吸附5 mL溶液中的目标物。而考虑乙腈提取样品时可以有效沉淀样品中大部分蛋白质。所以选择乙腈为提取液进行试验。这是因为，利巴韦林溶解性导致，利巴韦林结构中含有一个核糖分子，极易溶于水。水对利巴韦林的溶解性，强于MMIPs对利巴韦林的吸附性。而乙腈对目标物的溶解性弱于MMIPs的吸附性，所以可以利用乙腈提取目标物，用水洗脱目标物。这样的现象增加了实际样品检测方法建立的可行性。

2.7 方法加标回收率及方法稳定性实验

在阴性样品中分别加入标准溶液，使得样品中目标物含量为0.5，2.0和10.0 mg/kg，每个浓度水平，平行三组试验，按照1.2.10小节方法处理样品，并进行检测，结果见表2。

表2 三水平加标回收率及精密度实验结果

由表2可知，此方法对样品中利巴韦林检测的回收率在80.6%～90.2%之间，SRSD为4.38%，满足检测要求。该方法能达到回收率高、精密度好的效果，是因为分子印迹材料对目标物吸附能力强，富集效果好，选择良好的洗脱试剂，可以快速高效地洗脱分子印迹固相萃取中的目标物。

2.8 重复性

取阳性样品，按照1.3.10小节方法处理，进行检测。重复8次试验，以每次色谱峰峰面积的相对标准偏差计算定量重复性，以每次色谱峰出峰时间的相对标准偏差计算定性重复性，结果见表3。

表3 重复性实验结果

SRSD（定性）=0.22%，SRSD（定量）=2.60%。均小于3%，检测结果稳定，满足检测要求。由于分子印迹对利巴韦林吸附速度快，短时间内可以达到吸附平衡，且吸附效率很高，影响吸附效果的因素较少。在相对稳定的实验条件下，所以得到的检测实验结果相对稳定。而且分子印迹没有吸附样品中可能影响利巴韦林色谱行为的杂质，所以在色谱分离和检测过程中，利巴韦林可以在特定的时间范围内出现色谱峰。

2.9 检出限及线性范围

以30 min内基线的3倍噪声对应的浓度为仪器最低检出限，以仪器检出限按照方法稀释倍数计算方法检出限，以3倍检出限浓度对应的浓度为定量限。以30 min内基线的3倍噪声对应的浓度为仪器最低检出限，检出限为0.05 μg/mL。将仪器检出限带入方法中计算该方法的方法检出限，方法检出限为0.02 μg/g，定量限为0.05 μg/g，适用于微量检测。分别配制0.1，0.5，1.0，5.0，20.0和50.0 μg/mL利巴韦林标准溶液，以1.3.4小节的色谱条件进行检测。得到不同浓度标准溶液对应的色谱峰面积，以浓度为横坐标，面积为纵坐标，检测结果在0.1～50.0 μg/mL范围内呈良好线性，线性回归方程y=541.33x+12.092；相关性系数R2=0.999 8，满足检测要求。

3 结论

在成功制备了单分散性良好的磁性分子印迹微球的基础上，研究了该材料对利巴韦林的吸附容量，吸附pH条件，吸附溶剂等影响因素。以MMIPs为原料，C18、PSA、硫酸钠为辅料制备针对肉及肉制品中利巴韦林检测试验，样品处理过程使用的固相分散萃取填料。并建立实际样品中利巴韦林的检测方法。验证该方法的回收率，精密度，定量重复性，定性重复性，检出限和线性范围。均符合方法学要求，可以用于实际实验过程中。该方法操作简便，回收率高，结果稳定，样品处理耗时短，消耗有机试剂少，适合批量样品处理。