苹果汁的酶促褐变抑制方法

邢枫，张蕙铭，王美淇，夏伟良，金铁岩

延边大学农学院 （延吉133002）

苹果（Malusdomestica）由于其美味和优良的营养价值，已成为世界上种植和售卖量最广泛的水果之一[1]。苹果含有生物活性成分，尤其是酚类化合物，包括羟基苯甲酸、羟基肉桂酸、黄烷醇、黄酮醇、二氢查耳酮和花青素，它们有助于健康，例如抗氧化活性、抗炎活性、降胆固醇作用、心血管保护作用、抗糖尿病活性和抗癌活性。

研究表明，消费者对健康食品的兴趣日益浓厚，趋向于食用营养价值高、加工最少且不含合成添加剂的新鲜食品。酶促褐变是加工食品中的主要问题之一，例如鲜切水果（苹果、桃子、梨、香蕉、鳄梨等）和蔬菜（生菜、土豆、茄子等）、果汁等。它是由两种重要的酶引起的，即多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）。大约50%的新鲜水果损失是由酶促褐变引起的，它不仅会产生不良的棕色，还会降低水果的营养质量和感官特性。因此，研究人员和食品行业最近一直在研究最合适的程序，以最大限度地减少加工水果的酶促褐变[2]。食品的颜色外观是消费者在选择过程中考虑的指标之一[3]。食品褐变反应的发生通常会损害食品的颜色外观，并显著降低客户对产品的接受度[4]。科学家和食品技术专家因褐变效应对水果和蔬菜带来的长期影响表示担忧，这可能会影响一个国家的经济状况。

水果和蔬菜中发生的色素沉着过程可以是酶促褐变或非酶促褐变，具体取决于机制。非酶促褐变是指在食品中产生棕色色素沉着而不涉及任何酶活性的过程，并且与化学反应有关，例如美拉德反应、焦糖化和抗坏血酸褐变反应。新鲜水果或蔬菜的自然褐变是通过酶促褐变机制发生的。一个主要问题是酶促褐变，因为需要食物中存在的酶的作用和氧化才能发生[3]。水果和蔬菜的酶促褐变是不可取的，并且对食品生产商和食品加工业造成重大经济损失，因为该过程主要发生在收获后的处理、运输、储存和加工过程中。因此，酶促褐变不仅影响颜色变化，还导致营养和感官损失，导致适销性降低和消费者接受度降低。因此，酶促褐变的发展可能导致超过50%的易褐变食物被浪费。

酶促褐变反应主要由PPO或其他酶如过氧化物酶（POD）和酪氨酸酶引起[5]。在氧气存在下，当这些酶催化酚氧化为醌时，会发生酶促褐变。随后，这些醌与其他化合物反应并聚合成称为黑色素的棕色色素。然而，这种反应不会发生在新鲜水果和蔬菜中，因为它们的酶通过细胞区室与底物和酚类化合物分离。这可以解释机械损伤和组织损伤，这些损伤会降低植物细胞的膜完整性，从而导致产生的棕色改变。这种反应可以通过去除水果和蔬菜切割表面的氧气来防止。尽管如此，当氧气重新建立时，褐变可以恢复。因此，利用抗氧化剂和褐变抑制剂灭活导致褐变的酶在食品工业中被广泛应用，尤其是鲜切工业。为了控制鲜切食品中的褐变效应，抗坏血酸及其衍生物等抗氧化溶液因其还原特性而传统地被采用。尽管如此，它的效果还是不太好，而且往往是暂时的。考虑到这一点，食品加工业非常需要从天然来源中寻找具有抗褐变特性的新型食品添加剂，这些添加剂没有任何有害的副作用[6]。

目前延边州的苹果产业价值不高，珲春市人民政府高度重视苹果产业的发展，苹果种植、加工产业已经成为延边州重点支柱产业来发展区域经济、实施乡村振兴战略。延边州苹果产业只有提高苹果深加工技术，加大研究深度，才能增加价值，为延边州经济发展做出贡献。

试验以延边朝鲜族自治州珲春市富硒苹果为原料进行单因素试验，通过对苹果汁进行水浴加热、添加不同浓度的抗坏血酸和不同量的硫代硫酸钠，并测定经过处理的苹果汁的色度、褐变率、多酚氧化酶活性和总酚含量，找出最适宜的方法抑制酶促褐变，加快延边苹果产业发展，提高苹果的经济效益[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

苹果（吉林省延边朝鲜族自治州珲春市，板石镇孟岭村的富硒苹果）；邻苯二酚溶液（麦克林）；0.01 mol/L碘酸钾溶液（福林）；pH 6.4磷酸缓冲液（福林）；0.04 mol/L抗坏血酸溶液（科密欧）；5.5%偏磷酸溶液（福林）；0.5%可溶性淀粉（科密欧）。

1.1.2 主要仪器与设备

CM-5型分光测色仪（柯尼卡美能达投资有限公司）；FA-N/JA-N电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；DK-8D数显恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；U-3900紫外分光光度计（日立高科技公司）；101电热鼓风干燥箱（泰斯特仪器有限公司）；MN-B榨汁机（济南松下乐妻电器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

苹果汁的加工工艺流程：新鲜苹果→清洗→破碎→榨汁→粗滤→离心分离→苹果原汁→过滤→抑制酶促褐变→热装瓶→密封→杀菌→冷却→成品。

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 挑选

苹果当季新鲜采摘，没有病虫害，没有变质，没有疤痕，果实的大小和成熟度合适，新鲜，果肉饱满，无黑色斑点。

1.2.2.2 清洗

将挑选好的苹果用清水洗净，洗去苹果表面附着的杂物、灰尘、泥沙和微生物、残留农药，祛除果杆。

1.2.2.3 破碎

将洗净的苹果去皮后，将苹果分成合适大小的小块，以利于配制果汁，提高出汁率。

1.2.2.4 榨汁

苹果榨汁时要充分，避免浪费。迅速地榨出苹果汁，使其不与空气充分接触。

1.2.2.5 过滤

过滤是在动力或其他外力的作用下，浆料（或含有固体颗粒的热气体）中的液体（或气体）通过介质的操作，使固体颗粒和其他物质被过滤介质保留，与液体（或气体）分离[8]。如果过滤不充分，则会使苹果汁中的固体沉淀物过多，而过滤时间过久会使苹果汁与空气的接触时间延长，从而对试验结果产生不利的影响。所以，在这此试验中，用八层纱布过滤两次挤压的苹果汁，使苹果汁从沉淀物中释放出来。过滤的果汁应该是黄色的不含任何固体沉淀的不透明液体。

1.2.3 苹果汁抑制酶促褐变处理

1.2.3.1 不同温度水浴处理对苹果汁酶活性的影响

大多数多酚氧化酶在60 ℃水浴加热10 min就会被失活。然而，由于水果组织不耐高温，加热温度和加热时间过长都会造成苹果汁中养分的损失，因此需要对水浴的温度和时间进行严格把控。

试验中，取500 mL的苹果汁在60，65和70 ℃的水浴温度下加热10 min，然后测定0，15，30和60 min的变黑程度。注意：加热苹果汁时，应将烧杯口密封，以此来隔离空气。

1.2.3.2 不同的抗坏血酸浓度添加量对苹果汁酶活性的影响

抗坏血酸能抑制多酚氧化酶的活性，这是因为抗坏血酸是多酚氧化酶辅基铜离子的螯合剂，它与铜离子键相连，从而使多酚氧化酶失活，同时还起到护色作用。在一定的浓度范围内，抗坏血酸的抑制能力并不显著。所以从经济上来看，可以选择适当的抗坏血酸添加量。

取500 mL苹果汁中加入浓度分别为0.075%，0.1%，0.3%和0.5%的抗坏血酸，迅速搅拌后密封，以隔绝空气。分别在0，15，30和60 min后，检测它们的褐变程度。

1.2.3.3 不同硫代硫酸钠添加量对苹果汁酶活性的影响

二氧化硫作为一种高效的抗氧化剂，具有抑制酶促褐变的作用，使用方便，作用显著，被广泛应用于饮料和酒类的生产。但是，二氧化硫的浓度要受到严格的控制，如果过量的话，可能会引起中毒或者对身体产生不良的后果，还可能会引起消化系统、咽喉、气管、肝脏、肾脏等产生疾病。一般情况下，添加量在低于0.012 mg/mL以内可以安全食用，0.01 mg/mL左右的SO2足以使酶失活，但由于挥发、反应损耗等原因，通常还会上升到0.012 mg/mL以下。需要指出的是，这类药剂的加入可能会引起食品的褪色和维生素B1的损伤。

将0.003，0.004，0.005和0.006 g的硫代硫酸钠添加到500 mL苹果汁，并迅速搅拌后密封，将其与空气隔离。分别在0，15，30和60 min后检测它们的褐变程度。

1.2.4 数据处理

试验结果均采用平均值±标准差（x±SD）的形式表示，试验数据以及折线图均采用Excel 2016软件进行作图和数据统计，用SPSS 25.0软件进行差异分析，所有试验均重复3次。

1.3 对苹果汁褐变程度的测定

1.3.1 颜色的测定

褐变是影响果蔬采后贮藏品质和保鲜期最突出的问题之一，对果蔬的外观品质、商品价值及贮藏时间有极大的影响，进而造成很严重的经济损失[9]。酶促褐变是果汁在加工及贮藏过程中颜色变化的最主要原因，通常会在果汁榨汁过程中出现，果实在破碎时接触氧气，同时多酚氧化酶会刺激果汁中的酚类物质羟基化，再将羟基化的物质氧化形成醌，醌类物质发生后续反应产生了棕色色素的过程。因此，利用颜色差异，可以直观地观察苹果汁的颜色变化及酶促褐变的反应。新鲜榨出的苹果汁一般为乳白色或浅黄色，在接触到空气时会产生酶促褐变，并伴随着果汁颜色褐变。试验利用CM-5分光光度计对苹果汁的颜色进行分析，并对其色度进行测量。褐变率反映褐变程度，根据公式（1）计算[10]来表示。

式中：L0为样品开始时的L值；Lt为样品在时间t时的L值。

1.3.2 总酚含量的测定

方法：（1）高锰酸钾滴定法；（2）氨基安替比林比色法；（3）酒石酸比色法；（4）福林酚法。

试验采用福林酚法测定总酚含量。样品中总酚含量（mg/mL）按公式（2）计算。

式中：C为没食子酸质量浓度，mg/L；V为提取液体积，mL；N为稀释倍数；M为取样量，mL。

1.3.2.1 福林试剂的配制

在2 000 mL磨口回流装置内加入100 g钨酸钠（Na2WO4·2H2O），25 g钼酸钠（NaMoO4·2H2O），700 mL水，50 mL 85%的磷酸和100 mL浓盐酸，于40 ℃（文火）回流10 h，加入150 g硫酸锂（Li2SO4）和50 mL蒸馏水，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再蒸沸15 min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色。若溶液有绿色，需再加数滴液溴，再蒸沸除去，冷却后定容至1 000 mL，过滤，滤液置于棕色瓶中。

1.3.2.2 供试品溶液的制备

量取10 mL苹果汁，置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL 90%乙醇溶液，静止2 h，然后进行抽滤，用少量的90%乙醇溶液洗涤滤渣，将滤液置于100 mL棕色量瓶中，用90%乙醇溶液后定溶至刻度上。

1.3.2.3 没食子酸标准溶液的制备

分别吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL质量浓度为0.1 mg/mL的没食子酸溶液置于10 mL容量瓶中，然后加入1.0 mL的福林酚试剂，摇匀。再加入3.0 mL 100 g/L的碳酸钠溶液，混匀，定容，并在室温下避光放置2 h。在765 nm的波长下，测定不同浓度下没食子酸标准溶液的吸光度（3组平行对照），并绘制标准曲线（见图1）。

图1 没食子酸标准曲线

1.3.3 计算多酚氧化酶活性

量取1 mL苹果汁，加入蒸馏水，转移到50 mL容量瓶中并搅拌均匀，充分摇匀，吸出10 mL，倒入250 mL三角形烧瓶中。将1 mL pH 6.4的磷酸缓冲液以及5 mL 0.4 mol/L抗坏血酸溶液添加到其中，并将其完全混合。在充分振荡的同时，添加5 mL 0.2%的邻苯二酚溶液。为了保持氧的持续流入，溶液必须保持2 min的充分振荡。在摇动2 min后，添加5 mL 5%的偏磷酸溶液，使反应终止。然后添加1 mL 0.5%的淀粉溶液，用0.01 mol/L碘酸钾溶液对抗坏血酸残渣进行滴定，直到蓝色不变为止。

同时进行对照滴定。为此，抽取10 mL悬浮液，注入到另一只三角瓶中，加5 mL偏磷酸，再加入1 mL pH 6.4磷酸缓冲液，5 mL 0.4 mol/L抗坏血酸，再加淀粉液，同样用0.01 mol/L KIO3溶液滴定。样品中多酚氧化酶活性按公式（3）计算。

式中：A为多酚氧化酶活性（1 g在20 ℃下，1 min内氧化的抗坏血酸分子量）；50为分析材料悬浮液的总体积，mL；N为分析材料的质量，g；10为测定酶活性所需的悬浮液体积，mL；2为反应时间，min；a为用来滴定对照的0.01 mol/L KIO3溶液体积，mL；b为用来样品滴定的0.01 mol/L KIO3溶液体积，mL；5为0.01 mol/L抗坏血酸溶液每毫升换算为微克分子数抗坏血酸的系数。

2 结果与分析

2.1 不同温度水浴加热对苹果汁色度、褐变率、多酚氧化酶活性、总酚含量的影响

由图2可知，苹果汁随放置时间推移，L值均出现下降趋势。水浴加热苹果汁有效地抑制苹果汁的酶促褐变[11]。结果表明，用水浴加热可使苹果汁发生褐变，但褐变程度较小，汁液从乳白色转变为淡黄色，气味没有显著改变，对果汁品质无影响。水浴温度为70 ℃时，苹果汁的L值最大，表明苹果汁的酶促褐变抑制作用显著。但是随着时间的推移，苹果汁的颜色会越来越深，对苹果汁酶促褐变的抑制作用也会越来越弱。颜色变化程度用褐变率来表示，酶促褐变对苹果汁的色泽影响较大。不难看出随着温度的升高，苹果汁酶促褐变的褐变率降低，但在不同的时间下，苹果汁的褐变率随贮藏时间的增加而增加。通常情况下，多酚氧化酶的活性随着温度的升高而下降，但是苹果中的多酚氧化酶具有较高的热稳定性，高温时的酶不易失活。经过水浴加热抑制多酚氧化酶活性后，前期抑制能力较后期强，高温改变了苹果汁多酚氧化酶的空间结构，破坏了活性中心，有效地抑制了褐变[12]。但长期贮藏对多酚氧化酶活性的抑制效果并不明显，其原因可能在于当苹果汁回温后，有一定量的多酚氧化酶复活，这与苹果汁的酶促褐变密切相关。总酚含量是苹果汁非常重要的质量参数，它不仅影响果汁的味道和颜色，而且拥有强大的抗氧化能力和抗菌抗炎作用[13]。苹果呈褐色时，其总酚含量也随之下降，所以苹果汁中总酚含量越高，对其酶促褐变的抑制作用越强。因此水浴温度为70 ℃时，苹果汁的酶促褐变抑制作用最显著。

图2 经不同温度水浴加热10 min的苹果汁L值、褐变率、多酚氧化酶抑制率和总酚含量

2.2 不同抗坏血酸添加量对苹果汁色度、褐变率、多酚氧化酶活性、总酚含量的影响

由图3可知，由于抗坏血酸在褐变反应中将醌类物质还原，阻止醌类物质再氧化生成褐色物质，从而抑制褐变。当抗坏血酸浓度过高时，抗坏血酸可能会自身氧化导致非酶褐变[14]。所以，并不是添加的抗坏血酸量越多，对苹果汁的酶促褐变抑制效果就越好，过度地添加抗坏血酸并不能对苹果汁的酶促褐变起到抑制作用。随着抗坏血酸浓度的上升，苹果汁的总酚含量升高，出现这种趋势的原因可能是酶促褐变的发生，导致酚类物质被氧化，含量减少，添加了抗坏血酸后，一方面保护酚类物质不被氧化，另一方面将酚类的褐变中间产物醌及其衍生物还原成酚类物质，使得总酚含量升高，抗坏血酸浓度越高，还原性越高，还原的酚就越多[15]。添加0.5%抗坏血酸时，苹果汁中残留的总酚含量最高，表明对参与氧化褐变的酚类物质的抑制作用最有效。在折线图中，添加量为0.5%与添加量0.075%的作用效果差异不显著，但添加量却有很大差异。结果表明以0.075%的抗坏血酸添加量为最佳。

综上所述，添加0.075%与添加0.5%的效果相似，因此最经济可行的抗坏血酸添加量为0.075%。

2.3 不同硫代硫酸钠添加量对苹果汁色度、褐变率、多酚氧化酶活性、总酚含量的影响

由图4可知，随着硫代硫酸钠添加量的增加，其对苹果汁酶促褐变的抑制作用也会增强，硫代硫酸钠对苹果汁褐变初期的影响就较小，随着时间的推移，其对苹果汁褐变的抑制作用逐渐减弱，且对色泽的抑制作用逐渐减弱。但硫代硫酸钠的添加量必须严格控制，SO2气体的含量不能高于0.012 mg/mL，因此硫代硫酸钠的最佳添加量为0.006 g。

3 结论

通过3种不同的方法抑制苹果汁的酶促褐变，包括在水浴中加热钝化酶活性、加入抗坏血酸和硫代硫酸钠，测定出苹果汁的色度、褐变率、多酚氧化酶活性和总酚含量，综合评价苹果汁酶促褐变的抑制能力。经试验结果分析得出：水浴加热的最适温度为70 ℃；抗坏血酸最适宜的添加量为0.075%；硫代硫酸钠最适宜的添加量为0.012 mg/mL。在这些条件下可以较好地抑制酶促褐变的发生。考虑到成本和使用方便等因素，在常温下添加浓度为0.075%的抗坏血酸时，其苹果汁酶促褐变的抑制效果相对最好。此次研究结果可为解决苹果深加工中出现的酶促褐变现象提供参考，同时应该结合实际条件，根据不同的要求选择出最适宜的抑制酶促褐变的方法。