青楷槭树叶成分分析及其提取物的抗氧化能力研究

夏伟良，王美淇，张惠铭，邢枫，金铁岩

延边大学农学院 （延吉133002）

青楷槭（AcertegmentosumMaxim.）又称为青楷子、辽东槭，是无患子科槭属植物，其树形高大挺拔，叶色翠绿繁茂，是一种极具园艺观赏价值的树种。它生长在中国黑龙江、吉林、辽宁等省，在俄罗斯远东地区和朝鲜北部也很常见[1]。青楷槭树高10～15 m，树皮灰色，表面光滑，枝干无毛。叶尖及上面深绿色，有光泽，叶面浅绿色，叶脉腋处有淡黄色毛，近圆形或椭圆形，长10～12 cm，宽7.0～9.0 cm，钝尖，有强烈的齿。茎光滑，长4.0～7.0 cm，4月开花，9月结果。花黄绿色，单性，无毛。花盘和子房光滑，雄蕊短，雄蕊略带流苏，稍弯曲。种子有光泽，棕黄色，坚果稍扁平，翅钝或几乎水平展开，果柄细长，约5.0 mm[2]。研究表明，节疤树根、枝和树皮的提取物富含黄酮类、红景天苷和香豆素等多种化合物，具有抗氧化、抗菌、消炎和降血脂等作用，被广泛用于治疗出血性伤口和化脓性皮肤感染。最初对枫香的研究主要集中在该树种的栽培和生态方面，杜欣勇等[1]将枫香作为研究对象，在不同的土壤条件下开展研究，为枫香造林工作奠定了基础；其次王兴华[3]研究槭树的生物学特性和生长期的相关管理，为槭树的开发和利用奠定了基础。近年来，槭树逐渐被发现，不仅可用于观赏，其各种组织还具有重要的药用和治疗作用，如：邬楠等[4]发现，从槭树树干树皮中提取的提取物可有效预防脂多糖诱导的小鼠败血症，其机制被认为与提取物的抗氧化能力以及减少TNF-α和IL-6的释放有关；张鑫等[5]以青楷槭树皮水提取物为起始原料，进一步进行抗氧化和抗菌活性的体外研究，结果表明青楷槭热水提取物具有良好的自由基清除能力和抗菌能力；刘便强等[6]对青楷槭热水提取物的抗氧化和抗菌活性开展小试，结果表明青楷槭热水提取物具有良好的自由基清除能力和抗菌能力。研究了青楷槭不同部位提取物的抗氧化活性，结果表明各层均具有良好的抗氧化活性，其中乙酸乙酯层的抗氧化活性最强。在韩国和日本的民间医学中，青楷槭被认为是治疗疾病的良药。国外研究表明，枫叶提取物含有大量活性物质，具有广泛治疗特性，是功能食品和草本天然药物的候选品种，具有良好的市场前景。关于青楷槭的抗氧化活性，Lee等[7]发现青楷槭皮提取物具有很好的清除自由基和三价铁还原能力，而乙醇提取物的抗氧化活性更好；Eun等[8]在对青楷槭的抗糖尿病活性研究中证实青楷槭皮提取物的抗糖尿病作用。提取干燥的青楷槭茎，发现它能抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，而抑制α-淀粉酶能提高抗氧化活性。Kwon等[9]在对青楷槭提取物的抗糖尿病活性进行研究时发现，青楷槭皮提取物对肝癌细胞的生长有显著的抑制作用；Cho等[10]在对青楷槭提取物的高血脂酸化活性进行研究时发现，青楷槭茎和树皮提取物能降低血脂水平，使脂肪细胞体积缩小60 μg/mL。综上所述，青楷槭在药物产品的生产方面越来越受到青睐，从青楷槭中提取的黄酮与多酚等物质可清除自由基，具有很好的抗氧化能力，在降血脂、抑制糖尿病等方面的效果十分显著。但现阶段人们对其相关的深入生物活性研究并不充分，如：仅限于在其茎皮与树皮方面的研究，其他组织的生物活性方面还有待挖掘；青楷槭生理活性的研究中有较多测定指标，但对青楷槭树叶的体外抗菌抗癌研究缺少相关机制的阐述；在抗癌活性的研究中有较多局限还在传统认知的肝癌上，存在单一性，对于其他癌细胞是否能抑制尚不清楚。因此对青楷槭树叶 的生物活性研究进行更深入研究将对青楷槭的资源利用及推动青楷槭产业化发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青楷槭树叶：2022年5月于吉林省珲春市采集。

硫酸铜、硫酸钾、乙腈、苯酚、亚甲基蓝指示剂等，均为分析纯，购自上海麦克林生化科技有限公司；亚硝酸钠（NaNO2）、硝酸铝[Al(NO3)3]、氢氧化钠（NaOH）、抗坏血酸（VC）、柠檬酸（CTA），均为分析纯；DPPH标准品（色谱纯）、ABTS标准品（超纯），均购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

分析天平（YP2002型，上海科教仪器有限公司）；红外线水分测定仪（CSY-H5A型，深圳市分析仪器制造有限公司）；马弗炉（KSW型，沈阳市节能电炉厂）；索氏提取仪（SZF-06C型，浙江托普仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（DC-0506型，南京舜玛仪器设备有限公司）；全自动凯氏定氮仪（KN680型，济南阿尔瓦仪器有限公司）；原子吸收光谱仪（OES6000型，江苏天瑞仪器股份有限公司）；电热鼓风干燥箱（101型，泰斯特仪器有限公司）；紫外可见分光光度计[V-5800（PC）型，上海元析仪器有限公司]；电热恒温水浴锅（DK-8D型，无锡沃信仪器有限公司）；旋转蒸发仪（RE-2000B型，巩义市瑞德仪器设备有限公司）；全波长酶标分析仪（HBS-ScanY型，南京德铁实验设备有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 青楷槭树叶预处理

将试验用青楷槭树叶清洗干净，在通风处晾晒之后由粉碎机进行粉碎，放入-20 ℃冰箱中储存备用。

1.3.2 青楷槭树叶一般成分测定

水分测定，取2.0 g左右青楷槭树叶粉末置于红外线水分测定仪托盘中，均匀铺平，根据仪器提示规范操作，于105 ℃快速烘干，水量将以百分比直接显示在仪表屏幕上。

粗灰分含量测定，参照GB 5009.4—2016 《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》；蛋白质含量测定，参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》；粗脂肪含量测定，参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》；碳水化合物含量测定，以青楷槭树叶碳水化合物含量为100%中减去水分、粗灰分、蛋白质和粗脂肪所测定的含量；总膳食纤维含量测定，参照GB 5009.88—2014《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》。

1.3.3 游离糖含量

参照GB 5009.8—2016 《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》测定。

1.3.4 青楷槭树叶提取物抗氧化能力

将青楷槭树叶粉碎，过孔径0.180 mm（80目）筛，取50 g青楷槭树叶粉末按不同料液比、提取温度、提取时间进行制备，制备好的样品分别旋转浓缩，而后冻干成粉末，最终得到青楷槭树叶乙醇提取物（ATEE）和青楷槭树叶热水提取物（ATWE），于4 ℃冰箱储存备用。对青楷槭树叶提取物设计体外抗氧化试验测定青楷槭树叶提取物的抗氧化性。

DPPH自由基清除能力：参考Williams等[11]的方法稍作修改，测定ATEE和ATWE对DPPH自由基的清除能力。将ATEE和ATWE与阳性对照VC的溶液设置为0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL。称取30 μg的DPPH粉末，用无水乙醇定容至100 mL。将样品溶液与 DPPH溶液按1∶1比例加入96孔板中，在避光条件按式（1）计算。

式中：A空白为100 μL DPPH溶液+100 μL蒸馏水的吸光度；A样品为100 μL DPPH溶液+100 μL样品溶液的吸光度。

ABTS+自由基清除能力：参考Garzon等[12]方法稍作修改，测定ATEE和ATWE对ABTS+自由基清除能力。

将7 mmol/L ABTS与 2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，遮光处理16 h，配得ABTS+储备液。在测定ABTS+自由基清除能力前，将ABTS+储备液在734 nm波长处用蒸馏水稀释至吸光度为0.70±0.02的工作液。使用蒸馏水将待测样品溶液配制成质量浓度分别为0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL的溶液作为待测液，备用。取0.1 mL样品溶液与3.9 mL ABTS+储备液充分混匀后静置6 min，于734 nm波长处测吸光度，记为Ai；使用相同方法，取3.9 mL ABTS+溶液与0.1 mL蒸馏水混合，测定吸光度A0，取3.9 mL蒸馏水与0.1 mL样品溶液混合，测定吸光度为Aj。ABTS+清除率按式（2）计算。

式中：Ai为样品吸光度；Aj为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

铁离子还原能力：参照邵郅胜等[13]的测定方法稍加改动，测定ATEE和ATWE对铁离子的还原能力。分别移取5 mL质量浓度为0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL的ATEE和ATWE稀释液和阳性对照柠檬酸于试管中，分别加入5 mL 0.1% K3[Fe(CN)6]溶液和5 mL pH 6.6的PBS缓冲液充分混匀，在50 ℃下恒温水浴25 min后加入5 mL 10% TCA溶液充分反应。取反应后的溶液5 mL加入等量蒸馏水和1 mL 0.1% FeCl3溶液后放置10 min，于波长700 nm处测定其吸光度。

1.4 数据处理

所有试验均重复3次，使用 Excel 2020统计与计算数据；利用SPSS 22.0软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 青楷槭树叶一般成分的分析

试验测定青楷槭树叶中的一般成分含量，结果如表1所示。青楷槭树叶中水分、粗灰分、粗脂肪、蛋白质以及碳水化合物含量分别为13.11%，4.68%，5.36%，19.57%和56.28% 。在青楷槭树叶的碳水化合物中，膳食纤维在其中占比较高，含量为49.07%。膳食纤维在人体中发挥着重要的生理作用，它能改善肠道微生物结构，降低血糖和血脂水平，有助于预防肥胖、糖尿病和其他慢性疾病。膳食纤维可以增加有益菌的数量，抑制有害菌的生长，从而改善肠道菌群结构，通过调节胰腺的胰岛素和葡萄糖分泌，改善代谢紊乱和胰岛素拮抗作用，改变细胞氧化和抗氧化之间的平衡，减缓炎症反应，从而降低体内血糖水平，维持血糖稳定[14]。

表1 青楷槭树叶一般成分含量

2.2 青楷槭树叶游离糖含量的分析

试验测定青楷槭树叶中游离糖的含量，结果如表2所示。青楷槭树叶中的果糖含量最为丰富，其含量达5.08%，其次是葡萄糖，含量为3.42%，其中未检测出麦芽糖和乳糖。果糖能使人精力充沛，减轻疲劳。适量果糖能提高血糖水平，减少低血糖症，即低血糖引起的冷汗和黑眼圈[15]。

表2 青楷槭树叶游离糖含量的分析

2.3 DPPH自由基清除能力

与抗氧化剂的有效成分结合后，抗氧化剂的颜色消失，与抗氧化剂反应后，DPPH自由基被还原，导致吸收值下降，还原速度与它接受电子的数量，即自由基吸收能力有定量关系[16]。如图1所示，在试验浓度范围内，ATEE和ATWE的DPPH自由基清除率均与样品浓度关系呈正向相关，并在质量浓度1 mg/mL时，清除率分别为86.25%和64.03%。在测试范围内，ATEE的DPPH自由基清除率均高于ATWE，综上所述，ATEE与ATWE均有较好的DPPH自由基清除能力，且ATEE的DPPH自由基清除能力优于ATWE。

图1 ATEE和ATWE的DPPH自由基清除能力

2.4 ABTS阳离子自由基清除能力

如图2所示，在试验浓度范围内，随着浓度的上升，ATEE和ATWE对ABTS+自由基清除能力也逐渐增强，且在质量浓度1 mg/mL时，ATEE清除率达93.31%，此时ATWE清除率为78.96%。总体而言，ATEE与ATWE均具有较好的ABTS+自由基清除能力，且ATEE在ABTS自由基清除能力上优于ATWE。

2.5 铁离子还原能力

铁的还原能力是指在抗氧化剂存在下铁的还原程度（从三价铁到二价铁的转变）。分子一旦被还原就会改变颜色，在700 nm波长处二价铁含量与吸光度呈正相关关系，从而可通过分光光度法进行测定[17]。如图3所示，在试验浓度范围内，随着ATEE和ATWE质量浓度的增大，两者的铁离子还原能力均升高，浓度较低（0～0.1 mg/mL）时，两者所对应的铁离子还原力相差不大，随质量浓度升高（0.1～1 mg/mL），ATEE和ATWE铁离子还原力均有较大提升，质量浓度达到1 mg/mL时，ATEE的吸光度为2.76和ATWE的吸光度为1.84。综上所述，ATEA与ATWE均具有极强的铁离子还原能力，且ATEE的铁还原能力优于ATWE。

图3 ATEE和ATWE的铁离子还原能力

3 结论

试验测定青楷槭树叶中的基本成分、游离糖含量及其提取物的抗氧化能力。

青楷槭树叶中富含碳水化合物，其中很大一部分是纤维。研究和报告表明，膳食纤维可降低心血管疾病、冠心病、肥胖症、糖尿病和其他疾病的风险[18]；青楷槭树叶的膳食纤维含量较高，对改善相关领域可能具有良好的潜力，但可溶性与不可溶性成分的比例以及是否存在有效的活性功能还需进一步分析和研究。

果糖、葡萄糖和半乳糖是人体内的主要单糖，摄入相同量的果糖和葡萄糖时，摄入葡萄糖后血糖升高的速度远高于摄入果糖后血糖升高的速度，因此果糖及相关周边产品被广泛应用于糖尿病患者的膳食参考标准中；试验表明，果糖可作为能量来源，促进ATP合成，促进红细胞增殖，保护和维持正常的生理功能；青楷槭树叶中果糖含量较高，这为青楷槭树叶作为功能性食品原料提供理论依据。

结果表明：青楷槭树叶水分为13.11%，粗灰分为4.68%，粗脂肪为5.36%，蛋白质为19.57%，碳水化合物为56.28%，总膳食纤维为49.07%；青楷槭树叶中检测出3种游离糖，其中果糖、蔗糖、葡萄糖的含量分别为5.08%，1.37%和3.42%，未检测出麦芽糖和乳糖。在青楷槭树叶提取物的抗氧化试验中，将3种不同类型的抗氧化测定作为检测指标，结果表明ATEE和ATWE均具有良好的抗氧化能力，且两者质量浓度均与其抗氧化能力呈现正相关关系，并在总体上ATEE抗氧化能力优于ATWE。