金属离子对枯草芽孢杆菌发酵产γ-聚谷氨酸的影响

马双双，张英华，张杰，李珍爱，李艳艳，李海军,2,3*

1.山东福瑞达生物科技有限公司 （临沂 276715）；2.山东福瑞达医药集团有限公司 （济南 250098）；3.山东省药学科学院 （济南250098）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是一种由微生物合成、以谷氨酸为唯一单体的共聚高分子聚合物，其特点是溶液黏度高，具有高度的水溶性、保湿性、生物相容性、生物可降解性等优良特性，在医药、食品、化妆品、农业等领域具有广泛应用[1-6]。但高黏度的特点同时也限制了发酵过程中传质和传氧，导致γ-PGA发酵产量低，限制γ-PGA的推广应用[7-8]。针对上述问题，国内外开展大量研究工作，包括高产菌种筛选及改造、培养基及发酵工艺优化等，以期提高γ-PGA发酵产量，降低生产成本[9-14]。

金属离子在微生物培养中发挥至关重要的作用，它们不仅可以促进微生物的生长及其代谢产物的合成，而且可以调节酶的活性，保护生物体的基本组织及细胞的完整性，调整细胞的渗透压以及控制细胞的氧化还原电位等[15]，如：钠可维持细胞膜内外渗透压平衡；钾参与细胞运输系统的组成；钙调节质膜的通透性；镁能促进碳源的分解，加速菌体能量代谢；锌、铁、锰、铜等可作为酶的辅助因子，参与微生物代谢过程中的氧化还原反应，促进微生物生长[16-19]。因此，对培养基添加金属离子对自行选育的枯草芽孢杆菌FRD215产γ-PGA的影响情况进行研究，以期通过在培养基添加金属离子提高枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA的产量，为该菌株的工业化生产和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）FRD215，实验室自行选育和保藏的菌种。

种子培养基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，谷氨酸钠10 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，K2HPO42 g/L，pH 7.3～7.5，115 ℃，30 min。

发酵培养基：葡萄糖120 g/L（单独灭菌）、蛋白胨10 g/L、谷氨酸钠70 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L，K2HPO42 g/L、(NH4)2SO415 g/L，pH 7.3～7.5，121 ℃，20 min。

1.2 仪器与设备

电子分析天平、FE20 pH计[梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司]；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；ZHJH-C1115B垂直流超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；ZHWY-211B恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；3-18台式高速离心机（上海托莫斯科学仪器有限公司）；1200 Series高效液相色谱仪（Agilent Technologies）。

1.3 试验方法

1.3.1 培养方法

菌种培养：取菌种冻存管，菌种解冻后，取100 μL接种于装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，在37 ℃，250 r/min条件下培养12～16 h。

发酵培养：将培养好的菌悬液按5%的转种量，接种于装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，在37 ℃，250 r/min条件下培养72 h。

1.3.2 试验方法

1.3.2.1 单因素试验

在原发酵培养基基础上，分别添加不同浓度Na+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+，其他发酵条件不变，具体添加量按照表1所示，每个试验设置5个浓度梯度。

1.3.2.2 正交试验

经过单因素试验分析，采用正交试验的方法优化金属离子添加量，每组试验均设置3个平行，以获得更准确的结果。

1.3.3γ-PGA含量检测方法

采用凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography，GPC）测定γ-PGA含量。

色谱条件：Waters Uittrahydrogel 100[7.8 mm× 3 0 0 mm（内径）]色谱柱；流动相为10 mmol/L NaH2PO4·12H2O和15 mmol/L KH2PO4缓冲液，用0.22 μm的膜过滤器过滤；柱温30 ℃；流动相流速0.5 mL/min；检测波长210 nm；进样量20 μL。

γ-PGA标准品曲线制作：取约0.1 g标准品，精确至0.000 1 g；溶于20 mL纯化水中，搅拌1 h后，移至100 mL容量瓶中定容，配制成1 g/L母液，取适量母液逐级稀释，配制0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 g/L的质量浓度梯度的标准液；经0.22 μm微孔滤膜过滤。利用紫外检测器检测，建立峰面积和标准品浓度的标准曲线。

样品的配制：取约2.0 g样品，精确至0.000 1 g；溶于20 mL蒸馏水中，搅拌1 h后，移至100 mL容量瓶中定容，按12 000 r/min处理5 min；上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行检测分析。

1.3.4 数据分析

采用Origin 8.3和SSPSAU软件处理和分析试验数据。

2 结果与分析

2.1 Na+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-聚谷氨酸的影响

钠与维持细胞渗透压有关，是微生物发酵培养基的必要成分。试验在原发酵培养基中添加NaCl，探究Na+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA的影响，结果如图1所示。与对照组相比，添加量0.1～6.4 g/L对γ-PGA发酵产量无明显影响，添加量25.6 g/L时，PGA发酵产量降低29.4%。培养基中适当的Na+水平可保证细胞膜的稳态，促进菌体的正常繁殖及代谢。如果Na+水平超出正常范围，就可能引起细胞的质壁分离，导致菌体活性降低，进而影响目标产物的产量。试验结果说明培养基中Na+含量已足够维持枯草芽孢杆菌生产代谢需求。

2.2 Ca2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-聚谷氨酸的影响

钙存在于细胞中，控制细胞的生理状态，调节质膜的通透性，维持细胞体内的渗透压，同时钙离子还是许多酶的活性因子[16]。试验在原发酵培养基中添加CaCl2，探究Ca2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA的影响，结果如图2所示。0.1～0.8 g/L的Ca2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA有促进作用。与对照相比，随着CaCl2添加量的增加，γ-PGA产量逐渐增加，且添加量0.8 g/L时，γ-PGA产量达到最高，比对照组提高25.2%。添加量1.6 g/L时，γ-PGA产量较对照组下降30.6%。这可能是由于过量的Ca2+与培养基中的磷酸盐、硫酸盐发生反应生成沉淀，导致培养基中营养元素缺失，进而导致γ-PGA产量下降。

2.3 Mn2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-聚谷氨酸的影响

锰可以显著提升丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶等酶的活性，对芽孢杆菌芽孢的生成具有促进作用[15]。试验在原发酵培养基中添加MnSO4·H2O，探究Mn2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA的影响，结果如图3所示。0.1～0.8 g/L的Mn2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA有促进作用，但没有明显的浓度梯度效应。0.1 g/L和0.8 g/L的添加量γ-PGA的产量分别提高15.5%和16.4%。添加量1.6 g/L时，γ-PGA产量有所下降。这一结果与添加Ca2+的试验结果类似，过量的Mn2+与培养基中的磷酸盐发生反应生成沉淀，导致培养基中营养元素缺失，进而影响γ-PGA产量。

图3 Mn2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA的影响

2.4 Fe3+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-聚谷氨酸的影响

铁是菌体的细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素，是菌体生命活动必需的元素之一。试验在原发酵培养基中添加FeCl3·7H2O，探究Fe3+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA的影响，结果如图4所示。添加量0.02和0.04 g/L对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA有促进作用，γ-PGA产量较对照组分别提高12.1%和9.8%。0.08 g/L及以上添加量对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA有抑制作用，FeCl3·7H2O添加量0.32 g/L时，γ-PGA产量较对照组下降35.1%。

图4 Fe3+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA的影响

2.5 Cu2+、Zn2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-聚谷氨酸的影响

锌、铜可作为酶的辅助因子，参与微生物代谢过程中的氧化还原反应，促进微生物生长[21-22]。试验在原发酵培养基中分别添加CuSO4·5H2O和ZnSO4，探究Cu2+和Zn2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA的影响，结果如图5和图6所示。0.01～0.08 g/L浓度范围内，Cu2+和Zn2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA无明显影响。添加量0.16 g/L时，其对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA有抑制作用，γ-PGA产量分别降低17.8%和13.6%。

图5 Cu2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-聚谷氨酸的影响

图6 Zn2+对枯草芽孢杆菌发酵产γ-聚谷氨酸的影响

2.6 正交试验确定金属离子的最佳添加量

根据单因素试验结果，对枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA有正影响的金属离子分别是Ca2+、Mn2+、Fe3+。基于单因素试验，将CaCl2添加量（A）、MnSO4·H2O添加量（B）和FeCl3·7H2O添加量（C）作为研究对象，并以γ-PGA产量作为指标，采用L9(33)的正交试验表，详细分析各个因素的影响。正交试验因素水平如表2所示。结果与分析，如表3所示。

表2 正交试验因素水平 单位：%

表3 正交试验设计表及结果

从正交试验结果可知：影响枯草芽孢杆菌产γ-PGA的因素顺序为A＞C＞B，即CaCl2添加量＞FeCl3·7H2O添加量＞MnSO4·H2O添加量；最优组合为A2B2C2，即在原发酵培养基中同时添加CaCl20.8 g/L、FeCl3·7H2O 0.02 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L。在此条件下，γ-PGA产量达53.34 g/L，比原发酵培养基至少提高40.0%以上。

3 结论

近来国内外主要选用芽孢杆菌属为代表，研究微生物发酵法生产γ-PGA。培养基作为微生物发酵法中关键的一部分，对微生物的生长代谢影响巨大。而金属离子作为培养基中的重要成分，参与细胞中多种生化反应，是微生物正常代谢必不可少的一类营养物质[19-21]。探究6种金属离子对枯草芽孢杆菌FRD215发酵产γ-PGA的影响，单因素结果表明：不同种类、不同浓度的金属离子对枯草芽孢杆菌产γ-PGA的影响差别较大。其中：在培养基中添加一定量的钙、锰、铁离子可促进枯草芽孢杆菌产γ-PGA，而添加钠、铜、锌离子对枯草芽孢杆菌产γ-PGA无明显影响。通过正交试验进一步确定培养基中钙、锰、铁离子的添加量，分别为CaCl20.8 g/L、FeCl3·7H2O 0.02 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L，在此条件下，γ-PGA产量达53.34 g/L，比优化前至少提高40.0%以上。后续将继续进行小试和大试放大试验。

结果表明：发酵培养基中添加一定量的金属离子钙、锰、铁可提高γ-PGA产量，该结果对枯草芽孢杆菌FRD215大规模应用和γ-PGA大规模生产具有指导意义。