高产海藻糖菌株的选育及转化条件优化

周培华，张海韵，刘兰，钟文涛，廖燕芝，袁列江

湖南省产商品质量检验研究院，食品安全监测与预警湖南省重点实验室 （长沙410017）

海藻糖是由2个葡萄糖通过α-α-1-1糖苷键组成的双糖，它具有很多优异的化学性质和独特的生物活性[1-3]，尤其在一些极端环境中，它能够在生物细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征[4-7]。其因为独特的性能，在医疗、食品、药品、生化、分子生物学领域起着至关重要的作用，在相关行业有着“生命之糖”的美称[8-11]。海藻糖和麦芽糖的分子结构如图1所示。

目前海藻糖的生产主要通过化学合成和海藻糖相关酶系转化生产[12]，但是海藻糖生产相关的核心酶制剂大量依赖国外进口，国内为了打破该领域的技术垄断做了一系列的尝试，取得了一些成果，其中以微生物发酵最具发展潜力，但是据报道，目前海藻糖的生产菌株仍然存在底物转化率低，生产及后续提取繁琐等问题[13-15]。国内微生物发酵法的核心问题在用于海藻糖生产的微生物菌株生产效率太低，研究以一株能够转化麦芽糖生成海藻糖的耐热芽孢杆菌为出发菌株，通过γ-Co60诱变构建突变菌株库，通过自主建立海藻糖高产优质菌株筛选模型定向选育能够低成本、高效率转化麦芽糖生成海藻糖的优质菌株，并对突变菌株产业化潜力进行多方面考察，以期实现海藻糖生产领域的技术自主化。

1 材料与试剂

1.1 菌株

实验室从自然界温泉附近筛选得到的能转化麦芽糖生成海藻糖的耐热芽孢杆菌HS-202006211109-117，6 h可转化20 mg/mL麦芽糖（W/W）生成浓度为3.73 mg/mL海藻糖。

1.2 初筛平板培养基

(NH4)2SO40.5%，麦芽糖5%，NaCl 10%，丙酸0.01%，MgSO40.001%，ZnSO40.001%，琼脂3.5%，0.1%磷酸，调pH至3.0。

1.3 检测试剂

乙腈（色谱纯），一水合麦芽糖（纯度100.0%，安谱），海藻糖（分析纯99%，上海麦克林生化科技有限公司），麦芽糖（纯度95%，国药集团），嗜渗酵母 CICC32788，DG18琼脂培养基（北京陆桥），营养琼脂，脑心肉汤（BHI）（北京陆桥）。

1.4 试验耗材

氨基柱（sigma），10 mL EP管、无菌培养皿、100～1 000 μL移液枪，1～10 mL移液枪（艾本德）。

1.5 仪器与设备

AR423DCN电子天平（美国ohaus澳豪斯）；MIR-254培养箱（Panasonic松下电器产业株式会社）；LC-20A高效液相色谱仪（日本shimadzu岛津公司），J157数显折光仪（美国鲁道夫公司）；TG16-WS离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HVA-85高压蒸汽灭菌锅（日本平山Hirayama）。

2 方法

2.1 筛选方法

出发菌株γ-Co60诱变构建突变菌株库，涂布至1.2小节平板初筛培养基，具有转化麦芽糖生成海藻糖潜力的突变菌株能够在该培养基上生长。挑取生长旺盛的单菌落接种至20 mg/mL麦芽糖溶液中，转化若干时间，利用海藻糖不能被酵母发酵的生物特性，加入此次试验自主选育的优良嗜渗酵母快速消耗麦芽糖，再使用折光仪检测残糖浓度[16]，如果该菌株具备高效转化麦芽糖生成海藻糖能力，则折光仪测得值会较高，因此能高效转化麦芽糖生成海藻糖的目的突变株会在该环节脱颖而出，最后通过高效液相色谱（HPLC）法定性定量检测该菌株的海藻糖生产量。

2.2 突变菌株库构建

2.2.1 出发菌株菌悬液

耐热芽孢杆菌HS-202006211109-117划线接种至营养琼脂培养基中，出发菌株45 ℃培养2 d后，用无菌生理盐水10 mL刮洗，加入无菌生理盐水调至麦氏浊度2.0左右，摇匀分装在2 mL离心管备用。

2.2.2γ-Co60诱变致死试验，致死曲线绘制，突变菌株库构建

取8管分装好的出发菌株管，设置8个辐照梯度（300，600，900，1 200，1 500，1 800，2 100和2 400 Gy）进行辐照诱变。

将未照射菌液和不同辐照剂量诱变菌液各取1 mL加入9 mL无菌生理盐水，逐级稀释至105，吸取0.1 mL涂布至营养琼脂平板上，每管涂10个NA平皿，计算辐照诱变的致死率，辐照诱变致死率=（X0-Xn）/X0×100%，见表1。选取致死率在90%左右的辐照剂量对各出发菌株菌悬液管进行辐照，获得突变菌株库，用于后续筛选。

表1 出发菌株γ-Co60辐照诱变致死曲线表

2.2.3 嗜渗酵母折光仪联用检测非发酵糖

通过配制嗜渗酵母CICC32788菌悬液和制作海藻糖、麦芽糖的混合标准曲线，经过嗜渗酵母消耗发酵性糖后，利用数显折光仪进行标准曲线的制作和筛选菌株的转化产物的测定，筛选出转化生成海藻糖高的突变菌株。

2.2.4 HPLC检测海藻糖含量

分别精密称取约1 g恒重的海藻糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖定容到10 mL，各标准物质的单标质量浓度为100 mg/mL，分别取1 mL定容到10 mL，得10 mg/mL单标；分别各取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和2.0 mL的100 mg/mL的母液10 mL定容，得到质量浓度分别为2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和20.0 mg/mL的混合标准曲线。

HPLC色谱条件：色谱柱，氨基柱，柱温30 ℃；检测器，示差检测器；流动相配比，乙腈80%纯水20%，流速1.0 mL/min。

挑取2.2.3小节中检测值较高的突变菌株，接种至20.0 mg/mL麦芽糖溶液，在45 ℃培养箱发酵转化6 h后，于100 ℃水浴灭活。吸取适量经过0.22 μm滤膜后装入液相色谱小瓶，HPLC上机检测。

2.3 突变菌株遗传稳定性

将筛选鉴定的突变菌株划线接种至营养琼脂NA平板，获得纯化的单菌落，挑取生长优异的单菌落接种至营养琼脂斜面，一环划线接种至营养琼脂斜面于45 ℃培养36 h，而后4 ℃冰箱冷藏保存，另一环划线接种至另一营养琼脂NA平板，于45 ℃培养36 h，以此操作进行传代接种15代。培养结束后，按2.2.4小节HPLC方法检测每一代的转化麦芽糖生成海藻糖的能力，考察突变菌株遗传稳定性。

2.4 转化底物耐受度考察

选取遗传稳定性较好、海藻糖转化能力较强的F-2119，培养制作菌悬液，分别接种至20，25，30，35和40 mg/mL浓度麦芽糖溶液中，于45 ℃转化6 h，按2.2.3小节方法检测生成的海藻糖含量。

2.5 突变株对于转化温度的考察

选取遗传稳定性较好、海藻糖转化能力较强的F-2119，培养制作菌悬液，用无菌生理盐水调节麦氏浊度1.5，分别接种至20 mg/mL麦芽糖溶液中，分别于35，40，45，50，55和60 ℃转化6 h，按2.2.3小节方法检测生成的海藻糖含量。

3 结果与分析

3.1 致死曲线绘制，γ-Co60辐照剂量确立

出发菌株辐照诱变至死曲线绘制如图2所示。随着辐照强度的增加，致死率一直上升，直到剂量为2 100 Gy时，致死率达到99.53%。

图2 出发菌株HS-202006211109-117 γ-Co60辐照致死曲线

图3 突变菌株测定结果

3.2 突变菌株测定结果

通过对HS-202006211109-117和突变株的嗜渗酵母折光仪联用检测海藻糖含量，结果显示在正突变株中F-2119、H-5213和C-3017的转化产海藻糖量显著高于其他突变株。此3个正向突变株转化产物稀释后再经过HPLC进行验证测定，结果显示，测定结果同初筛结果一致。

3.3 突变株遗传稳定性实验结果

突变菌株C-3017、F-2119、H-5213分别经过15次传代培养，每代的转化生成海藻糖的结果如图4所示。转化率和稳定性各菌株显示各自的特征，其中F-2119转化率和稳定性最优。

图4 突变株C-3017、F-2119、H-5213转化生成海藻糖的遗传稳定性考察

3.4 突变株转化底物浓度耐受度实验结果

F-2119的转化不同浓度麦芽糖生成海藻糖的能力如图5所示。随着底物浓度的升高，转化率呈下降趋势，考虑得率与转化率，底物浓度选择25 mg/mL。

图5 突变株F-2119转化不同浓度底物麦芽糖生成海藻糖的能力考察

3.5 突变株转化温度耐受度实验结果

F-2119不同温度下转化麦芽糖生成海藻糖的能力如图6所示。随着温度的升高，转化率呈上升趋势，升到一定温度后，转化率又会下降，故转化温度选择55 ℃。

图6 突变株F-2119不同温度转化麦芽糖生成海藻糖的能力考察

图7 转化条件优化前后突变株转化生成海藻糖的能力考察

3.6 转化条件优化后突变株转化生成海藻糖试验结果

通过比较初始转化条件底物浓度20 mg/mL、转化温度45 ℃与优化后转化条件底物浓度25 mg/mL、转化温度55 ℃，产物海藻糖浓度由14.30 mg/mL提高到16.46 mg/mL。

4 结论与讨论

在传统海藻糖高产菌株选育的工作中，传统检测海藻糖的方法一般有三氯乙酸提取法结合硫酸蒽酮法、海藻糖酶降解法结合硫酸蒽酮法、液相色谱法[17-18]。以上3种方法检测过程极其繁琐，检测成本非常高，无法将其应用于针对数万突变菌株筛选的检测，对此文章使用自建选育模型和高效筛选方法，通过自己的设计、研究和实验，构建了酿酒酵母差量消耗联用折光仪法，大量排除不产海藻糖或低产海藻糖的突变菌株，从而实现了该筛选模型的高通量性，最后将筛选获得的突变菌株结合高效液相色谱进行定性定量确认。利用此筛选模型，从自然界中获得能够转化麦芽糖生产海藻糖的菌株——耐热芽孢杆菌HS-202006211109-117，6 h转化麦芽糖生成海藻糖量为3.73 mg/mL，以此为出发菌株，通过诱变及选育模型的筛选得到3株具有海藻糖生产潜力的C-1037，F-2119和H-5123，6 h转化麦芽糖生成海藻糖量C-1037（12.31 mg/mL）、F-2119（14.30 mg/mL）、H-5123（16.61 mg/mL），较出发菌株分别提高到3.30，3.83和4.45倍，通过遗传稳定性实验确定F-2119遗传稳定性最好，最具有产业化潜力。随后对突变菌株F-2119的转化底物浓度耐受性和转化温度耐受性进行试验考察，得出麦芽糖底物浓度为25 mg/mL，转化温度为55 ℃时，转化效率较初始条件提高15.1%，较高浓度底物和较高转化温度可以减少在规模化生产的过程中的杂菌污染。

综上所述，文章建立的海藻糖高产菌株选育模型是一种通量高、筛选压力足、准确性很好的菌株定向选育模型，可以在短时间内在数以万计的突变株中快速筛选获得海藻糖产量高且性能优异的突变菌株，该选育模型对微生物法生产海藻糖将起到极大的推动作用。