微波辅助提取酿酒葡萄皮渣花色苷及抗氧化性研究

刘志伟，吕淑娟，赵琳，张媛雯，李庆亮，谭伟*

1.枣庄学院食品科学与制药工程学院/山东省石榴精深加工工程技术研究中心 （枣庄 277160）；2.枣庄学院生命科学学院 （枣庄277160）

葡萄自丝绸之路传入中原后便被广泛应用推广，陕西、山东等地是葡萄的主要产区[1-2]。经多年发展，我国在世界葡萄酒消费市场占主要地位，葡萄酒行业在2020年全国营业收入达100.21亿[3-4]。葡萄酿酒产业的蓬勃发展使得葡萄酿酒副产物葡萄皮渣的产量不断上升。葡萄皮渣内富含白藜芦醇、单宁、天然色素、黄酮、多酚等功能性物质，但大部分的葡萄皮渣多被用作肥料或饲料，其利用率极低且会对环境造成一定的污染[5-7]。目前已有研究人员将葡萄皮渣内活性成分添加到食品领域，以提高产品的感官与营养价值[8-11]。

花色苷属于花色素类物质，对葡萄酒颜色起关键作用，是一类天然存在于植物中的水溶性色素[12]，其绿色无毒，安全性高，具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗癌等药理作用[13-15]。因此对酿酒葡萄皮渣综合应用的研究可提高葡萄皮渣利用率，延长食品产业链，降低对环境的不良影响。目前关于花色苷常用的提取方法有浸提法、酶解提取法、超高压提取法等[16]。Liu等[17]通过变功率微波辅助提取法，在最优条件下得到84.82%的蓝莓花色苷萃取率。许丹妮等[18]采用双水相法提取葡萄皮渣花色苷的最佳工艺需要在酸性条件下使用乙醇和硫酸铵液体，但试剂污染可能性较大。黄茜等[19]提取葡萄皮花色苷选用了内部沸腾法，所得最佳工艺需在85 ℃下提取5 min，所用时间短，但过高的温度不利于花色苷结构稳定。郝俊光等[20]试验发现在真空度0.08 MPa下提取120 min才能达到毛葡萄皮渣花色苷提取的最优工艺，但试验时间过长，不适用于工厂加工和推广。

经文献[17-20]比较，采用“西拉”葡萄皮渣为原料，柠檬酸为提取剂，利用微波进行辅助处理，通过单因素试验与正交试验，筛选出酿酒葡萄皮渣花色苷的最佳提取工艺；分析其对DPPH与ABTS+的清除能力，为葡萄酿酒葡萄皮废渣的综合利用提供科学依据，为其进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“西拉”酿酒葡萄皮渣由山东君顶酒庄有限公司提供，烘干后，去籽留用；柠檬酸（国药试剂有限公司）。

XH 200A型祥鹄电脑微波固液相合成/萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；PHS-2F数字pH计（上海澳司豪仪器有限公司）；UV-2600 紫外分光光度计（日本岛津公司）；CPA224S万分之一电子天平（德国塞多利斯公司）。

1.2 花色苷提取与含量计算

将干燥后的葡萄皮进行粉碎，准确称取1.000 g葡萄皮粉末于试管中，按照不同的料液比加入柠檬酸溶液，在一定微波功率下提取一定时间后，得到花色苷提取液。

将1.0 mL提取液分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液定容至10 mL，暗处理2 h后，用紫外分光光度计测定其在700 nm和520 nm波长处的吸光度，选用pH示差法测定计算总花色苷含量[21]。

1.3 试验方法

1.3.1 不同柠檬酸浓度条件下花色苷提取

柠檬酸浓度分别设置为1.5%，2.0%，2.5%，3.0%和3.5%，设置微波功率450 W、微波时间20 min、温度45 ℃、料液比1∶25（g/mL），根据提取的总花色苷含量选择出最佳柠檬酸浓度。

1.3.2 不同料液比条件下花色苷提取

料液比分别设置为1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35（g/mL），设置微波功率450 W、微波时间20 min、柠檬酸浓度2.5%，根据提取的总花色苷含量选择出最佳料液比。

1.3.3 不同微波功率下花色苷提取

电气设备的质量问题首先体现在安装方面，因为安装过程中的动、静触头无法实现完全的接触，或者是接触面积达不到安全性的需要，也可能是因为动力不足，也容易存在很多的安装操作失误的情况，从而导致了接触面积存在严重的电热氧化问题，在具体的应用过程中电阻增大，使得触头出现了强击电流，造成了触头出现了损伤的情况，使用寿命也无法满足使用的需要。其次，断路器中的弧触安装中存在很多的问题，比如接触力度不足等问题，使得在正常工作的过程中触头结构的温度持续的上升，使得温度过高而存在绝缘介质的分化，压力会急剧的提升，一旦操作不当就会出现因为温度超高而出现爆炸的危害，极易造成工程安全性无法满足要求[2]。

微波功率分别设置为350，450，550，650和750 W，设置料液比1∶25（g/mL）、微波时间20 min、柠檬酸浓度2.5%，根据提取的总花色苷含量选择出最佳微波功率。

1.3.4 不同微波时间下花色苷提取

微波时间分别设置为10，20，30，40和50 min，设置微波功率450 W、料液比1∶25（g/mL）、柠檬酸浓度2.5%，根据提取的总花色苷含量选择出最佳微波时间。

1.4 正交试验

在单因素试验的基础上，采用四因素三水平研究柠檬酸浓度、料液比、微波功率、微波时间四个因素对酿酒葡萄皮渣花色苷提取含量的影响，以此达到优化其提取工艺的目的。

1.5 DPPH自由基清除的能力测定

参照张泽生等[22]的方法略作修改。将质量浓度分别为0.4，0.8，1.2，1.6和2.0 mg/mL的葡萄皮渣花色苷提取液，分别与25 mg/L甲醇溶液混合均匀，黑暗反应20 min后在515 nm波长处测定吸光度A1；用无水乙醇代替葡萄皮渣花色苷提取液，按照同样的方法，测定吸光度A0，重复测定3次。DPPH自由基清除率=

1.6 ABTS+·清除能力的测定

根据王月等[23]的方法略作修改。将7.4 mmol/L ABTS+·溶液与2.6 mmol/L K2S2O8溶液混合，室温暗处理12 h后用无水乙醇将混合液稀释。将不同浓度的葡萄皮渣花色苷提取液与ABTS+工作液摇匀混合，室温静置6 min，在734 nm波长处测定吸光度A1。用无水乙醇代替葡萄皮渣提取液，同样操作，测定吸光度A2，重复测定3次。ABTS+·清除率

1.7 数据处理与统计分析

数据处理采用Excel 2013，每个数据为3次重复测量数据的均值和标准差。用SPSS 16.0数据分析软件在P≤0.05水平下进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 柠檬酸浓度对酿酒葡萄皮花色苷提取影响

图1 不同柠檬酸浓度对酿酒葡萄皮渣花色苷提取含量的影响

2.1.2 料液比对酿酒葡萄皮花色苷提取影响

如图2所示，提取所得总花色苷含量随料液比的减小呈先上升后降低趋势。当料液比达到1∶25（g/mL）时，提取的总花色苷含量达到最高，提取量为2.238 mg/g；料液比为1∶15（g/mL）提取的总花色苷含量最低。因此，选择最佳料液比1∶25（g/mL）及两边的1∶20（g/mL），1∶30（g/mL）作为正交试验料液比的3个水平。

图2 不同料液比对酿酒葡萄皮渣花色苷提取含量的影响

2.1.3 微波功率对酿酒葡萄皮花色苷提取影响

如图3所示，总花色苷提取量随微波功率的提高，总体上呈逐步上升趋势。当微波功率为750 W时，花色苷提取量达到最高，为3.313 mg/g。因此，考虑到功率与电量的关系，选择750，650和550 W作为正交试验微波功率的3个水平。

注：不同小写字母表示不同处理之间差异显著（P＜0.05）。

2.1.4 微波时间对酿酒葡萄皮花色苷提取影响

如图4所示，总花色苷含量随微波时间的延长呈先上升后下降的趋势，含量在3.375～4.323 mg/g之间。微波时间40 min时，总花色苷含量最高，比30 min时高6.83%。因此，去掉总花色苷含量最低的两个水平，选择最佳微波时间40 min及30 min，20 min作为正交试验微波时间的3个水平。

注：不同小写字母表示不同处理之间差异显著（P＜0.05）。

2.2 正交试验结果及分析

经上述单因素试验分析，选择各因素的三水平按照L9(34)进行正交试验，正交试验表如表1所示。

表1 酿酒葡萄皮花色苷提取正交因素水平设计表

通过正交试验对酿酒葡萄皮查花色苷的提取条件的分析，结果表明，影响酿酒葡萄皮总花色苷含量提取的四个因素影响主次顺序为料液比＞柠檬酸浓度＞微波功率＞微波时间（见表2）。最佳提取工艺为料液比1∶30（g/mL）、2.50%的柠檬酸浓度、微波功率750 W、微波时间40 min。在此条件下做3次重复试验，所得总花色苷含量最高，为4.461 mg/g。

表2 花色苷提取正交试验分析表

2.3 酿酒葡萄皮花色苷对DPPH自由基和ABTS+·自由基的清除能力

从图5可以看出，酿酒葡萄皮渣花色苷对DPPH自由基和ABTS+自由基均具有较强的清除能力，且随质量浓度的逐步提高，清除能力逐渐增强。当酿酒葡萄皮渣花色苷的质量浓度达到2.0 mg/mL时，其对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率分别可达76.20%和96.82%。

图5 葡萄皮渣花色苷对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力

3 讨论及结论

葡萄皮渣作为葡萄副产品是一种可添加的生活功能性食品成分，其内富含的花色苷具有着色功能，可视为人工合成添加剂的绿色替代品[24]。目前关于花色苷最常用的提取方法有溶剂浸提法、超声辅助法、微波辅助提取法、加压液体提取法等。黄瑜等[25]使用双水相法提取葡萄皮渣中花色苷，在最优条件（乙醇质量分数为28.00%，硫酸铵质量分数为18.14%，pH 3.00，料液比为1∶35 g/mL）下花色苷得率为4.430 mg/g。张岩等[26]利用单因素试验和响应面法优化了超声提取葡萄皮渣花色苷的工艺，以2.50%的磷酸为提取剂，在料液比1∶25 g/mL，超声功率300 W，50 ℃下超声25 min，提取的花色苷含量为4.034 mg/g。文章主要研究微波辅助柠檬酸提取酿酒葡萄皮渣花色苷，通过单因素试验与正交试验优化了微波提取酿酒葡萄皮渣花色苷工艺的优化。最优条件：2.50%的柠檬酸为提取剂，在50 ℃下微波40 min，微波功率为750 W，选用1∶30（g/mL）的料液比，在此条件下，平行试验3次，提取的花色苷含量为4.461 mg/g，提取率可达4.461‰，高于前人研究。提取的花色苷对DPPH和ABTS+·自由基的清除能力较高，表明其具有较强的抗氧化能力。

综上：试验采用柠檬酸为提取液，在提高花色苷萃取率的同时降低试剂污染，不仅提取物的安全性得到提高，对自由基的清除能力也有所增强，为花色苷进一步应用于食品、保健、医疗等领域提供可行性的理论依据；试验过程中采用的温度适中，利于花色苷的结构稳定；微波工艺用时短、效率高、工艺简单，大大降低了试验时间与能耗，可在大规模生产的工厂中进行推广。