罗平小黄姜总黄酮提取工艺的优化及抗氧化活性研究

刘静，刘继华，叶朋飞，李秋达，张春艳，黄慧福*

1.曲靖职业技术学院 （曲靖 655011）；2.曲靖师范学院 （曲靖655011）

生姜是姜科多年生草本植物姜（ZingiberofficinaleRoscoe）的新鲜根茎，市面上所种植和销售的生姜品种有面姜、大肉姜、竹根姜、张良姜、小黄姜等20余种。小黄姜在云南种植面积广泛，主要分布在曲靖、文山、红河等地，其中以罗平小黄姜品质最佳，且为当地的特色产业及致富产业，曾在2019年入选中国农业品牌目录。罗平县地处滇东高原东南部，气候温润，素有“姜之乡”之称，所产小黄姜质细纤小，色泽鲜黄，姜味浓郁，截至2021年底，罗平小黄姜种植面积15 667 hm2，为当地农民收入的重要经济来源[1-2]。《中药大辞典》中曾记载：小黄姜，性辛温，味辛辣、微甘、微苦。生姜是生活中不可缺少的调味料，含有姜辣素[3]、黄酮类[4]、多酚类[5]等多种活性物质，具有抗氧化[6-8]、消炎杀菌[9-10]、抑制肿瘤细胞增殖[11-13]、缓解糖尿病并发症[14-15]等功能。黄酮类化合物为中药中常见的物质，且为生姜主要的抗氧化成分[16]。

试验选取液料比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数为单因素，并对所得最优单因素数据进行正交试验，确定罗平小黄姜中总黄酮的最佳提取工艺，并对小黄姜总黄酮提取液进行体外抗氧化活性研究，为小黄姜的深度开发提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗平小黄姜（购于曲靖农产品批发市场）。芦丁（纯度≥98%，南京奥多福尼生物科技有限公司）；抗坏血酸（分析纯，纯度≥99.7%，西陇科学股份有限公司）；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·，纯度HPLC＞97.0%）、2,2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS+·，纯度＞98.0%），上海蓝季科技发展有限公司；无水碳酸钠（分析纯，天津市登峰化学试剂厂）；过硫酸钾（分析纯，济南金昊化工有限公司）；亚硝酸钠、硝酸铝（均为分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；无水乙醇（分析纯，天津风船化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

CP214电子分析天平（奥豪斯仪器有限公司）；UV-5600PC紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；XMTD-204数显恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）；XFB-500粉碎机（吉首市中诚制药机械厂）。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

标准曲线的绘制参照吴存兵等[17]的方法并稍作改进。配制质量浓度0.2 mg/mL的芦丁标准溶液，待用。吸取0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL芦丁标准品溶液于25 mL具塞试管中，分别加入1.0 mL 5% NaNO3溶液，摇匀放置5 min，分别加入1.0 mL 10% Al(NO3)3溶液，摇匀放置5 min，再分别加入10.0 mL 1.0 mol/L的NaOH溶液，用80%乙醇定容，摇匀后放置10 min，在510 nm波长处测定吸光度。以芦丁标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，制作标准曲线，得回归方程y=2.668 7x-0.008 5（R2=0.999 6）。

1.3.2 总黄酮提取率的计算

黄酮类化合物在亚硝酸盐作用下，与Al(NO3)3发生络合反应生成黄色铝络合物，在碱性条件下显红色，510 nm波长下有最大吸收波长，因此可采用NaNO2-Al(NO3)3显色法，以芦丁作为标准品制作标准曲线，以510 nm作为检测波长测定吸光度，对比芦丁标准曲线，计算黄酮含量。

称取10.000 0 g姜粉于500 mL烧杯中并加入一定浓度和体积的乙醇溶液，在一定温度条件提取一定时间，减压抽滤，滤液定容于100 mL容量瓶，得待测液，取1 mL待测液，按1.3.1的方法测定吸光度，同时做空白处理，小黄姜中总黄酮的提取率按式（1）计算。

式中：C为提取液黄酮质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；N为提取液稀释倍数；M为提取黄酮的生姜粉末质量，g。

1.3.3 单因素试验

选取不同梯度的液料比（15∶1，20∶1，25∶1，30∶1和35∶1 mL/g）、提取温度（50，60，70，80和95 ℃）、提取时间（1，2，3，4和5 h）、乙醇体积分数（40%，50%，60%，70%和80%）进行单因素试验，分析各单因素对罗平小黄姜总黄酮提取率的影响。

1.3.4 正交试验

根据单因素试验结果，以液料比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、乙醇体积分数（D）为影响因素，进行四因素三水平L9(34)的正交试验，对小黄姜中总黄酮的提取工艺进行优化。正交试验因素与水平表见表1。

表1 正交试验因素与水平表

1.3.5 小黄姜总黄酮体外抗氧化试验

运用最优工艺条件对小黄姜中的总黄酮进行提取，以此为母液，配制0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mg/mL的黄酮溶液为待测液，进行体外抗氧化试验。

1.3.5.1 DPPH·自由基清除率的测定

DPPH·自由基清除率的测定方法参照董贺等[18]的方法，并加以改动。取2.0 mL黄酮待测液和相同浓度的VC参照溶液于具塞试管中，配制0.1 mmol/L的DPPH·溶液，向上述试管中加入2.0 mL的DPPH·溶液，室温下暗处静置30 min后在波长517 nm处测定其吸光度。DPPH·清除率按式（2）计算。

式中：A1为加入样品溶液的DPPH·吸光度；A2为未加DPPH·的样品溶液吸光度；A0为加入无水乙醇的DPPH·吸光度。

1.3.5.2 ABTS+·自由基清除能力的测定

ABTS+·自由基清除能力的测定参照夏雨弘等[19]的方法并加以改动。取ABTS+·自由基溶液（6.6 mmol/L）和K2S2O8溶液（3.2 mmol/L）等体积混匀，避光放置17～22 h，将ABTS+·自由基溶液用无水乙醇进行稀释，直至吸光度为0.70±0.02。

分别吸取0.2 mL不同浓度的黄酮溶液和相同浓度的VC参照溶液于具塞试管中，加入3.8 mL ABTS+·自由基溶液，混匀于暗处反应5 min，在波长734 nm下测定吸光度。ABTS+·自由基清除率按式（3）计算。

式中：A4为加入样品溶液的ABTS吸光度；A5为未加ABTS的样品溶液吸光度；A3为加入无水乙醇的ABTS吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对小黄姜总黄酮提取率的影响

如图1所示，液料比15∶1～25∶1（mL/g）时，小黄姜总黄酮提取率逐渐增大，并在25∶1（mL/g）时提取率达到最大4.847%。液料比25∶1～35∶1（mL/g）时，总黄酮的提取率随之下降。分析原因可能是随着溶剂体积的增加，小黄姜中的总黄酮已被基本提取出，且可能会浸出其他物质，导致黄酮的提取率下降，且会造成溶剂的浪费[20-21]。因此，最佳液料比为25∶1（mL/g）。

图1 液料比对黄酮提取率的影响

2.1.2 提取温度对小黄姜总黄酮提取率的影响

如图2所示，提取温度在50～80 ℃时，小黄姜中总黄酮的提取率逐渐上升，并在80 ℃时达到最大4.272%，随着提取温度继续升高，提取率下降。随着温度的升高，分子的运动加快，黄酮类化合物能快速转移到溶剂中，但温度高于80 ℃时，黄酮提取率下降，分析可能由于温度的升高，黄酮类物质的结构被破坏，导致提取率下降[22]。因此，最佳提取温度为80 ℃。

图2 提取温度对黄酮提取率的影响

2.1.3 提取时间对小黄姜总黄酮提取率的影响

如图3所示，小黄姜中的提取率随着提取时间的延长而先上升后下降，并在提取时间2 h时达到最大4.920%。提取时间2～5 h时，总黄酮的提取率逐渐下降，分析原因可能是随着提取时间的延长，小黄姜粉末中的其他杂质与黄酮类物质存在提取竞争关系，小黄姜粉末中的其他物质也被提取出来，导致总黄酮提取率的降低[23-24]。同时提取时间过长，提取成本增加。因此，最佳提取时间为2 h。

图3 提取时间对黄酮提取率的影响

2.1.4 乙醇体积分数对小黄姜总黄酮提取率的影响

如图4所示，乙醇体积分数40%～70%时，小黄姜中总黄酮的提取率逐渐增大，乙醇体积分数70%时达到最大4.545%。乙醇体积分数70%～80%时，总黄酮的提取率逐渐下降。分析原因可能是高体积分数乙醇提取出非黄酮性成分，造成总黄酮提取率下降[25]。因此，最佳乙醇体积分数为70%。

图4 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

2.2 正交试验结果

选取液料比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、乙醇体积分数（D）为单因素进行正交试验，试验结果见表2。

表2 正交试验结果及分析

根据正交试验结果中极差值分析可知，各因素对小黄姜总黄酮提取率的影响顺序为A＞B＞C＞D，即为液料比＞提取温度＞提取时间＞乙醇体积分数。小黄姜中总黄酮的最佳提取工艺条件为A2B2C3D1，即料液比25∶1（mL/g）、提取温度80 ℃、提取时间2.5 h、乙醇体积分数65%。同时，根据最佳提取条件组合进行3次平行验证试验，结果取平均值，为4.959%。试验结果表明在此条件下，提取率最高。

2.3 小黄姜总黄酮体外抗氧化试验

2.3.1 DPPH·自由基清除率的测定

对运用最佳工艺条件提取到的小黄姜总黄酮溶液和VC溶液进行DPPH·自由基清除试验，结果如图5所示。质量浓度0.2～1.0 mg/mL时，VC对DPPH自由基的清除能力增加迅速，随后趋于平缓；小黄姜总黄酮提取液对DPPH自由基的清除能力随着总黄酮浓度的不断增加而不断增强，但仍低于VC的对DPPH自由基的清除能力。质量浓度1.0 mg/mL时，小黄姜总黄酮对DPPH·清除力达到最大79.27%。

图5 小黄姜总黄酮对DPPH自由基的清除作用

2.3.2 ABTS+·清除率的测定

对运用最佳工艺条件提取到的小黄姜总黄酮溶液和VC溶液进行ABTS自由基清除试验，结果如图6所示。随着质量浓度增大，VC溶液对ABTS+·清除能力上升很快且强于小黄姜总黄酮提取液对ABTS+·清除力。质量浓度在0.2～1.0 mg/mL时，小黄姜总黄酮的质量浓度与对ABTS+·清除力呈现正相关，质量浓度1.0 mg/mL时，小黄姜总黄酮对ABTS+·清除力达到最大91.26%，与VC溶液的清除能力相当。

图6 小黄姜总黄酮对ABTS+·的清除作用

3 结论

小黄姜为曲靖市罗平县的特色农产品，辣味充足，风味独特，获得海内外消费者的青睐。此次试验以罗平小黄姜为试验材料，通过单因素试验和正交试验得到小黄姜中总黄酮提取的最佳工艺条件：料液比25∶1（mL/g）、提取温度80 ℃、提取时间2.5 h、乙醇体积分数65%。在此条件下，小黄姜中总黄酮的提取率达4.959%。体外抗氧化试验表明，在一定质量浓度范围内，小黄姜总黄酮溶液的质量浓度与DPPH·、ABTS+·自由基的清除能力呈正相关，且自由基的最大清除率分别为79.27%和91.26%，表明小黄姜总黄酮提取液具有一定的自由基清除能力，为后续小黄姜的开发利用提供一定依据。