牙膏中三七皂苷TLC定性检测法的改进

陈玉玲

(云南诺特金参口腔护理用品有限公司,云南 昆明 650212)

引言

三七药物牙膏已有近四十年的历史,呵护了几代云南人的口腔健康。云南三七牙膏秉承三七药物牙膏而来,采用云南文山道地药材三七提取物,内含活性成分,保留三七止血功能的同时,专注口腔护理,秉承药物牙膏的工艺积淀。

《本草纲目》中记载:三七具有“止血、散血、定痛”的功效, 又名“金不换”。药用成分主要是三七总皂苷[1], 三七总皂苷又包含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1等成分, 具有消炎、消肿、止血、镇痛的作用[2]。研究表明含三七的中药牙膏可以帮助减轻口腔溃疡、牙菌斑、牙龈炎和牙龈出血等[3～6]。

云南三七牙膏为磷酸氢钙与二氧化硅复配体系,区别于大多数牙膏类型,且功效型牙膏行业标准QB/T 2966-2014附录F——人参皂苷、三七皂苷薄层的色谱鉴别方法出台时间已经相对较久,《中国药典》也已经更新至2020版本,很多检测方法也已改进。为了检测结果更加准确,便于平时检测需要,特针对云南三七牙膏中三七皂苷的TLC检测法进行了研究及改进。

1 实验材料

1.1 实验材料和试剂

本实验所采用的的牙膏均为三七牙膏(云南诺特金参口腔护理用品有限公司出品);对照品:110703人参皂苷Rg1、110704人参皂苷Rb1、110754人参皂苷Re、110745三七皂苷R1(中国食品药品检定研究院制造,北京中科质检生物技术有限公司供货)。

石油醚(沸程60℃～90℃)、石油醚(沸程30℃～60℃)、氢氧化钠0.1mol/L(1→20)、无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司);浓硫酸、甲醇(成都市科隆化学品有限公司);三氯甲烷(利安隆博华(天津)医药化学有限公司);正丁醇(天津市致远化学试剂有限公司);乙酸乙酯(天津市恒兴化学试剂制造有限公司);中性氧化铝(天津市风船化学试剂科技有限公司);纯化水。

1.2 实验仪器与设备

层析缸、层析柱、分液漏斗、抽滤瓶、G3坩埚、毛细管、硅胶G薄层板(50*100mm青岛海洋化工厂分厂);分析天平(AUX120岛津企业管理(中国)有限公司);恒温磁力搅拌器(85-2,常州国华电器有限公司);双频超声波清洗机(SY3200DH,上海声源超声波仪器设备有限公司);循环水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ),巩义市予华仪器有限责任公司);电子恒温水浴锅(DZKW-4,北京中兴伟业仪器有限公司);电热鼓风干燥箱(GZX-9030MBE,上海博迅实业有限公司医疗设备厂);超纯水机(LYLSUPTC-20L,上海力辰邦西仪器科技有限公司)。

2 实验步骤

2.1 试剂和层析柱的制备

水饱和的正丁醇溶液:将正丁醇与水(1∶1)混合,摇匀,放置过夜(超声波10min即可)取上层。

硫酸乙醇(1→10)溶液:取10ml浓硫酸加入100ml容量瓶,缓慢加入无水乙醇至刻度线即可。

使用中性氧化铝湿法装柱,柱高5～7cm,适当压实,无断柱,无气泡空洞产生最佳。

2.2 对照品溶液的制备

取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rg1对照品及三七皂苷R1对照品,加甲醇制成每1ml各含0.25mg的混合溶液,作为对照品溶液。

2.3 改进前样品的制备及测定

按照功效型牙膏行业标准(QB/T 2966-2014)所写的实验方法进行实验时发现,在加入石油醚去除表面活性剂K12时会产生大量乳白色化合物,初次蒸干后仍然残留部分CMC或黄原胶,且展开剂在常温下无法明显展开,在紫外灯照射下无法显出荧光点。针对这一实验结果,做出了后续调整。

2.4 改进试验

2.4.1 石油醚及萃取次数的选择

功效型牙膏行业标准(QB/T 2966-2014)中所用石油醚为沸程60℃～90℃,目前K12标准中所用石油醚为沸程30℃～60℃,为更好地在萃取过程中除去牙膏中的K12, 还应增加萃取次数,以萃取过程和萃取结束的感官为评价标准,选出适宜的结果。

2.4.2 展开剂的选择

实验2.2中所用的展开剂三氯甲烷-甲醇-水(7∶3∶0.5)在观察实验结果时发现无法展开各个点位,更换展开剂为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10),以分离度为评价标准,选出合适的展开剂。

2.4.3 展开剂温度的选择

实验2.2.3中选出的展开剂均在常温下展开,发现点位不清晰,控制展开剂温度在5℃、10℃、15℃下展开,以点位和显色是否清晰为评价标准,选出适宜的温度。

2.4.4 乙醇洗脱液浓度的选择

对比30%、35%、50%的乙醇洗脱出的单独点板检测,以皂苷荧光点个数为评价结果,选出适宜的乙醇浓度。

2.5 新TLC检测方法的确定

为了验证所选出的4个条件是否适宜,故进行重复性实验,以硅胶板上所显点位及个数与对照品对比结果,得出适用于三七牙膏中三七皂苷的TLC检测方法。

3 实验结果

3.1 石油醚及萃取次数的选择

由表1可知,石油醚的选择及萃取次数对实验过程影响较大,选择60℃～90℃萃取3次后再用30℃～60℃萃取2次,所得到的试样溶液效果最好。

表1 石油醚及萃取次数的选择结果

3.2 展开剂的选择

由表2和图1、图2可知,所选展开剂为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)的分离效果更好。

表2 展开剂的选择结果

图1 展开剂1的展开效果

图2 展开剂2的展开效果

3.3 展开剂温度的选择

由表3及图3、图4、图5可知,在展开剂为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)的情况下,在5℃下展开的薄层板点位显色较清晰。

表3 展开剂温度的选择结果

3.4 乙醇洗脱液浓度的选择

由表4及图6、图7、图8可知,不同浓度的乙醇洗脱会对稀有皂苷的荧光点有影响,浓度低或高都会使得稀有皂苷荧光点消失,所以采用浓度为35%的乙醇洗脱效果最好。

表4 乙醇洗脱液浓度的选择结果

3.5 新TLC检测方法的确定

由以上实验选出的最佳条件,得出适用于三七牙膏中三七皂苷TLC检测方法,结果如图9所示。

即:称取牙膏25g,置于100ml锥形瓶中,加入95%乙醇60ml,用磁力搅拌器搅碎牙膏,使之均匀后,超声波30min～1h。静置后,上清液用G3坩埚抽滤,用95%乙醇40ml分两次洗涤滤渣,并抽滤。滤液置于蒸发皿中,在90℃水浴锅上浓缩至粘稠状物。加水30ml溶解,转移至60ml分液漏斗中,石油醚(沸程60℃～90℃)萃取3次,(沸程30℃～60℃)轻摇法萃取2次,每次用量20ml。弃去石油醚层,水层用水饱和的正丁醇萃取3次,使用正常萃取手法,每次用量50ml、25ml、25ml,弃去水层,上层溶液置于蒸发皿中, 在90℃水浴锅上蒸发干,冷却后残渣加水10ml溶解,水溶液上中性氧化铝层析柱。先用pH值为10左右的氢氧化钠0.1mol/L(1→20)100ml溶液洗脱,再用300水,最后使用35%乙醇40～60ml洗脱,收集35%乙醇洗脱液置于蒸发皿中,在90℃水浴锅上蒸发干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试样品待用。

按照薄层色谱法(通则0502)试验,毛细管吸取上述两种溶液各1μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂,5℃下展开,取出,快速烘干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品中主要成分的色谱点,在与对照品色谱点相应的位置上,显相同颜色的斑点;置紫外光灯(365nm)下检视,显相同的荧光斑点。

a :对照品点,b c d e :供试品点

4 结论

该研究以磷酸氢钙与二氧化硅复配体系牙膏(三七牙膏)为例,在缺少高效液相色谱仪的情况下,以薄层色谱法来验证产品是否符合配方要求,经过与行业标准不同的尝试实验,最终得出适宜三七牙膏的TLC检测法,为药物牙膏的质量又增添了一份保障。但需要注意无论在石油醚萃取或水饱和正丁醇萃取时,使用正常萃取手法轻摇几下即可,不可用力过猛,以免造成过多的损失,影响实验结果。

随着各行各业对自己产品质量越来越重视,即使在设备不足的情况下,也应该严格把控好自己的产品质量,才能在激烈的竞争中立于不败之地。