高效液相色谱法测定炒榧子仁饮片中油酸和亚油酸含量*

2024-03-18李志霞李翠华侯金良李正国

中国药业 2024年5期

李志霞，李翠华，侯金良，李正国

（山东省济宁市食品药品检验检测研究院，山东济宁 272000）

榧树主要分布于长江流域以南地区的浙江、安徽、江苏、福建、湖南、湖北、江西、四川、云南、贵州等省，其中浙江省资源最多［1-2］。香榧的主要产区为会稽山的诸暨、绍兴、东阳、嵊州、磐安等，诸暨市种植面积最广，产量最大，品质最佳，有“中国香榧之乡”之称［3-5］。榧子为红豆杉科植物榧Torreya grandisFort. 的干燥成熟种子［6］，炒制加工后香脆味美，营养价值极高。榧子仁中富含脂肪油、蛋白质、碳水化合物［7-10］，其中脂肪酸多为不饱和脂肪酸，并含有19 种氨基酸和192 种矿物元素［11-13］。榧子为我国传统驱虫中药，同时又是特有的珍稀干果，营养丰富，为药食同源中药［14］。榧子的营养价值及其药效均与榧子所含成分直接相关，受采种时间及种子成熟度的影响，榧子所含成分的含量波动较大［15］。研究表明，香榧子油具有调血脂、降低血清胆固醇的作用，可软化血管，促进血液循环，调节老化的内分泌系统［16-17］，对动脉粥样硬化形成的预防作用明显［18］。目前，市场上的榧子产地较多，而各地炮制规范中的榧子仁只进行了常规定性检验，无法控制其内在质量。榧子仁油脂中含有7种脂肪酸，以亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸为主，不饱和脂肪酸占脂肪酸总数的79.41%［19］。故本研究中建立了测定炒榧子仁饮片中油酸和亚油酸含量的高效液相色谱（HPLC）法，以有效控制饮片质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC - 2030C 3D 型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司），配有二极管阵列检测器；XS205DU 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为十万分之一）；SK8200LHC 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为53 kHz）。

1.2 试药

乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；磷酸（色谱纯，美国Tedia 公司）；水为娃哈哈纯净水；亚油酸对照品（批号为111622-201704，含量为99.8%），油酸对照品（批号为111621-201707，含量为99.9%），均购于中国食品药品检定研究院；榧子仁饮片（编号为1 - 13，样品信息见表1），其中7 批药材为生品，6 批药材按2020年版《中国药典（四部）》通则0213项下炮制通则及2012年版《山东省中药饮片炮制规范》项下方法，委托山东嘉泰中药饮片有限公司炒制。

表1 榧子仁饮片样品信息Tab.1 Information of Torreyae Semen Tostum samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：ThermoHypersilGoldC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（78∶22，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论板数按亚油酸峰计应不低于5 000，且分离度不小于1.5。色谱图见图1。

1. 亚油酸 2. 油酸图1 系统适用性试验高效液相色谱图1.Linoleic acid 2.Oleic acidFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别取亚油酸对照品47.14 mg、油酸对照品58.02 mg，精密称定，分别置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，即得亚油酸和油酸对照品贮备液。分别精密吸取亚油酸对照品贮备液15.00 mL、油酸对照品贮备液5.00 mL，置同一50 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分别含亚油酸0.141 14 mg、油酸0.057 96 mg 的混合溶液，即得混合对照品溶液A。分别精密吸取亚油酸对照品贮备液15.00 mL、油酸对照品贮备液5.00 mL，置同一100 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分别含亚油酸0.070 57 mg、油酸0.028 98 mg 的混合溶液，即得混合对照品溶液B。

供试品溶液：取样品粉末（过2 号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率为500 W，频率为53 kHz）60 min，放冷，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液A 2，4，6，8，10，12，14，16 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以对照品进样量（X，μg）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，得亚油酸回归方程Y=1 617 755X+19 734（R2=1.000 0，n=8），得油酸回归方程Y=445 735.49X-731.36（R2=1.000 0，n= 8）。结果表明，亚油酸的进样量在0.282 3～2.258 2 μg、油酸的进样量在0.115 9～0.927 4 μg 范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.2 项下混合对照品溶液B 10 μL，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果亚油酸峰面积的RSD为0.56%（n=6），油酸峰面积的RSD为0.12%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为20201103）适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果亚油酸平均含量为4.787 mg/g、RSD为0.69%（n=6），油酸平均含量为1.576 mg/g、RSD为0.50%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为20201103）0.5 g，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于0，100，200，300，400，500，600，700 min 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果亚油酸峰面积的RSD为0.33%（n=8），油酸峰面积的RSD为0.91%（n=8），表明供试品溶液在室温下放置700 min内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20201103）9 份，每份约0.25 g，精密称定，置锥形瓶中，分别精密加入亚油酸对照品溶液（质量浓度为0.559 0 mg/mL）和油酸对照品溶液（质量浓度为0.210 7 mg/mL）1，2，3 mL，各3 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 炒榧子仁饮片中亚油酸和油酸加样回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test of linoleic acid and oleic acid in Torreyae Semen Tostum（n = 9）

2.4 样品含量测定

取样品（编号为1-13）适量，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定2次，记录峰面积，并计算含量。结果见表3。

表3 炒榧子仁饮片中亚油酸和油酸含量测定结果（%，n=2）Tab.3 Results of the content determination of linoleic acid and oleic acid in Torreyae Semen Tostum（%，n = 2）

3 讨论

3.1 含量限度拟订

由表3 可知，不同产地和同一产地、不同批次的炒榧子仁饮片中亚油酸和油酸含量差异较大，这与药材不同产地的地理环境、气候条件、采收加工等直接相关。含量限度制订中，去除含量明显偏低的13号样品和含量明显偏高的3号样品，计算亚油酸和油酸的平均总含量为（0.65±0.34）%，则最小值为0.31%，故建议炒榧子仁饮片中亚油酸和油酸的总含量不得低于0.30%。

3.2 提取方法选择

曾对提取溶剂（甲醇、90%甲醇、80%甲醇）、提取方法（超声提取和加热回流提取）、提取时间（超声提取30，45，60 min）进行了考察。结果以甲醇为提取溶剂时提取效果较好；超声提取和加热回流提取效果相同，超声提取30 min 提取不完全，提取45 min 和60 min 的效果相同，但炒榧子仁油性大，粉碎后黏度大，提取过程中不易分散。故最终确定样品提取方法为以甲醇为提取溶剂，超声提取60 min。