注射用泮托拉唑钠中有关物质研究*

王 晔，刘 骅，王辰雯，马 莉

（1. 安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051； 2. 海南卫康制药有限公司，海南 海口 570100）

泮托拉唑钠为质子泵抑制剂，通过特异性作用于胃黏膜细胞而抑制胃酸分泌，主要用于治疗消化性溃疡、反流性食管炎等［1-2］。2020年版《中国药典（四部）》9102 药品杂质分析指导原则中规定，杂质检查分析方法应专属、灵敏，主成分与杂质和降解产物均应能分开，检测限应满足限度检查的要求［3］。2020年版《中国药典（二部）》中，采用高效液相色谱法测定，以主成分自身对照法计算注射用泮托拉唑钠中有关物质，且系统适用性试验中仅规定了泮托拉唑钠与氧化降解产物的分离度，不能有效区分、控制相关杂质［4］。《美国药典》《欧洲药典（11.0 版）》中对有关物质杂质D 和杂质F 均以混合物进行杂质控制，不利于产品质量控制［5-6］。为此，本研究中采用加校正因子的自身对照法测定注射用泮托拉唑钠中有关物质，以提高杂质的质量控制水平。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），配有二极管阵列检测器（PDA）；XS105DR 型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

泮托拉唑钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100575 - 201505）；杂质A 对照品（C16H15N3O5F2S，批号为CAS127780 - 16 - 9），杂质B 对照品（C16H15F2N3O3S，批号为CAS102625-64-9），杂质C对照品（C8H6F2N2OS，批号为CAS97963-62-7），杂质D+F对照品（《美国药典》商品化对映异构体混合物对照品C17H17F2N3O4S，批号为CAS624742-53-6，杂质D 含量为58.5%，杂质F 含量为41.5%），杂质E 对照品（C32H28F4N6O8S2，批号为CAS2115779-15-0），均购于上海麦克林生化科技有限公司；杂质D 和杂质F色谱定位用对照品（自制，杂质D，批号为HX - PTL2 - D -2018，含量为99.95%；杂质F，批号为HX - PTL2 - F -2019，含量为98.31%）；磷酸氢二钾、氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，默克美国Sigma 化学公司）；水为二次蒸馏纯净水；注射用泮托拉唑钠（安徽某企业，编号为1-6，规格为每瓶40 mg）。

2 泮托拉唑钠有关物质测定

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱Thermo Hypersil ODS C18柱（125 mm×4.0 mm，5 μm）；流动相：A 为0.01 mol/ L 磷酸二氢钾缓冲液（用20%磷酸调pH 至7.0），B 为水-乙腈（1∶99，V/V），梯度洗脱（程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：290 nm（杂质A，B，E，D + F）和305 nm（杂质C）；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。在此色谱条件下，各杂质均能有效分离。色谱图见图1。

1. 杂质C 2. 杂质A 3. 泮托拉唑 4. 杂质D + F 5. 杂质E 6. 杂质B图1 系统适用性试验高效液相色谱图1.Impurity C 2.Impurity A 3.Pantoprazole 4.Impurity D + F 5.Impurity E 6.Impurity BFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

表1 流动相梯度洗脱程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2 溶液制备

分别取有关物质杂质A，B，C，D+F，E 对照品各适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释成每1 mL 含0.1 mg的溶液，摇匀，作为各杂质对照品贮备液。

取泮托拉唑钠对照品适量，精密称定，加氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解，并定量稀释成每1 mL 含泮托拉唑2 mg 的溶液，摇匀，作为泮托拉唑钠对照品贮备液。

精密量取各杂质对照品贮备液0.1 mL、泮托拉唑钠对照品贮备液2 mL，置同一10 mL 容量瓶中，加氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）稀释并定容，摇匀，作为系统适用性溶液。

取样品，精密称定，加氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg / L）- 乙腈（1∶1，V/V）溶解，并定量稀释成每1 mL含泮托拉唑钠0.4 mg的溶液，作为供试品溶液。

取辅料，按样品工艺与处方制备空白辅料样品，按供试品溶液制备方法制备溶液，作为空白辅料溶液。

参考国外药典自身对照为0.1%的浓度，供试品溶液色谱图任何小于对照品溶液主峰面积0.5 倍的峰忽略不计。精密量取供试品溶液0.1 mL，置100 mL容量瓶中，加氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）定容，摇匀，作为自身对照溶液。

2.3 各杂质校正因子计算

杂质A，B，D + F，E 的校正因子均在0.9～1.1 之间，于290 nm 波长处检测含量时校正因子按1.0 计算；杂质C 的校正因子约为0.3，于305 nm 波长处检测含量时校正因子按0.3计算。结果见表2。

表2 各杂质相对于泮托拉唑钠主峰的校正因子Tab.2 Correction factors of various impurities relative to the main peak of pantoprazole sodium

2.4 方法学考察

专属性试验：空白辅料溶液及配伍溶剂（0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液）均不干扰注射用泮托拉唑钠中有关物质检测，且于290 nm 和305 nm 波长处杂质A - F 间，以及与泮托拉唑钠间的分离度均理想，表明方法的专属性良好。色谱图见图2。

a. 杂质A b. 杂质B c. 杂质C d. 杂质D + F e. 杂质E f. 泮托拉唑1. 系统适用性溶液 2. 空白溶剂 3. 空白辅料溶液 4. 葡萄糖注射液 5. 氯化钠注射液A.290 nm B.305 nm图2 专属性试验高效液相色谱图a.Impurity A b.Impurity B c.Impurity C d.Impurity D + F e.Impurity E f.Pantoprazole1.System suitability solution 2.Blank solvent 3.Blank excipient solution 4.Glucose Injection 5.Sodium Chloride InjectionA.290 nm B.305 nmFig.2 HPLC chromatograms of the specificity test

干扰试验：1）酸破坏。取样品1 瓶，加0.1 mol/L 盐酸溶液1 mL 破坏1 h 后，加0.1 mol / L 氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg / L）mL 中和，置100 mL 容量瓶中，加氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg/ L）- 乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，摇匀，即得。2）碱破坏。取样品1 瓶，加1 mol/ L 氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg/ L）mL破坏16 h后，加1 mol/L 盐酸溶液1 mL中和，置100 mL容量瓶中，加氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，摇匀，即得。3）氧化破坏。取样品1 瓶，置100 mL 容量瓶中，加氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解，加0.3%过氧化氢1 mL，破坏20 min 后，加溶剂稀释并定容，摇匀，立即进样。4）光照破坏。取样品1瓶，光照5 000 lx破坏30 d，置100 mL 容量瓶中，加氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg/L）- 乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，摇匀，即得。5）高温破坏。取样品1瓶，60 ℃高温破坏30 d，置100 mL容量瓶中，加氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，摇匀，即得。对样品及空白辅料进行酸、碱、高温、光照、氧化强制降解试验［7-8］。结果经酸、碱、高温、光照、氧化破坏后检测，主峰处均未检出有关物质，主峰纯度符合规定。各降解杂质均不干扰目标杂质的检测，分离度良好。杂质C 在光照破坏条件下增加明显；杂质D + F 在高温破坏条件下增加明显，在光照条件下呈增长趋势；杂质A在氧化破坏条件下增加显著。色谱图见图3。

1. 泮托拉唑 2. 杂质A 3. 杂质C 4. 杂质D + FA. 酸破坏 B. 碱破坏 C. 氧化破坏 D. 光照破坏 E. 高温破坏图3 破坏性试验高效液相色谱图1.Pantoprazole 2.Impurity A 3.Impurity C 4.Impurity D + FA.Acid damage B.Alkaline damage C.Oxidative damage D.Light damage E.High - temperature damageFig.3 HPLC chromatograms of the destructive test

检测限确定：按色谱图信噪比（S/N）为3∶1 计算各杂质及泮托拉唑钠的检测限。结果杂质A，B，C，D+F，E及泮托拉唑钠的检测限分别为0.24，0.29，0.80，0.71，0.30，0.30 ng，均远低于拟订的杂质限度，表明方法灵敏度良好。

稳定性试验：24 h内供试品溶液中杂质C 含量及总杂含量明显增长，供试品溶液临用新配，自身对照溶液24 h内峰面积RSD变化较小，表明溶液稳定性良好。

加样回收试验：各杂质按杂质限度50%，100%，150%加标至供试品溶液中，每个浓度平行3份，扣除样品基底，计算加样回收率及RSD。各杂质的加样回收率均在90%～110%范围内，RSD均小于10.0%（n=9），表明方法准确度良好。

2.5 杂质D+F 检测

2.5.1 色谱条件与系统适用性试验

流动相：A 为0.01 mol/L 磷酸氢二钾溶液（用磷酸调pH 至7.0），B为水-乙腈（1∶99，V/V），梯度洗脱（程序见表3）；检测波长：290 nm；其余色谱条件同2.1 项下。取杂质D + F 对照品和泮托拉唑钠对照品各适量，精密称定，加乙腈适量使溶解，并用氢氧化钠溶液（质量浓度为40 mg/ L）- 乙腈（1∶1，V/V）稀释成每1 mL含泮托拉唑0.4 mg、杂质D+F 2.4 μg 的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液。结果出峰顺序依次为泮托拉唑、杂质D 和杂质F。杂质D 和F 的分离度为1.1，基本达到基线分离，空白溶剂、空白辅料及其他杂质峰对杂质D 和杂质F的检测均无干扰。色谱图见图4。

1. 泮托拉唑 2. 杂质D 3. 杂质F图4 杂质D和杂质F的系统适用性试验高效液相色谱图1.Pantoprazole 2.Impurity D 3.Impurity FFig.4 HPLC chromatogram of the system suitability test of impurities D and F

表3 调整后的流动相梯度洗脱程序（%）Tab.3 Gradient elution program of the mobile phase after the adjustment（%）

2.5.2 方法学考察

检测限确定：按色谱图S/N为3∶1 计算杂质D 和杂质F 的检测限，结果杂质D 和杂质F 的检测限均为0.01 μg/mL，供试品溶液主峰质量浓度为0.4 mg/mL（相当于主成分的0.002%），表明该色谱系统灵敏度适合检测杂质D和杂质F。

加样回收试验：分别配制相当于杂质限度50%，100%，150%的加标供试品溶液，每个浓度平行3 份，扣除样品基底，计算加样回收率及RSD。结果杂质D 和杂质F 的加样回收率均在90%～110%范围内，RSD均小于10.0%（n=9），表明方法准确度良好。

2.6 注射用泮托拉唑钠中有关物质标准制订及样品测定

由图1 可知，泮托拉唑钠主峰及杂质D +F 分离度达到3.0 以上，采用自身对照法，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各杂质的峰面积（杂质C 于305 nm 波长检测）分别乘以相应的校正因子后与自身对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质含量。结果见表4。拟订杂质A - F 分别不得过0.2%，0.1%，0.2%，0.5%，0.1%，0.5%，其他单个杂质含量不得过0.2%，总杂质不得过1.0%。其中，杂质含量均相当于泮托拉唑标示量。

表4 6批样品中有关物质含量测定结果（%）Tab.4 Results of the content determination of related substance in six batches of samples（%）

3 讨论

注射用泮托拉唑钠在国内临床使用范围很广［9-10］，对有关物质进行严格合理控制，可保证药品使用的安全性和可靠性［11-12］。2020年版《中国药典（二部）》中收载的注射用泮托拉唑钠采用主成分自身对照法配制了1%自身对照溶液［13］，规定“最大单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5 倍（0.5%），总杂质峰不得大于对照溶液主峰面积（1%）”，但仅规定最大单个杂质限度在0.5%不够合理和客观。前期试验发现，泮托拉唑钠及杂质A，B，D + F 均于290 nm 波长附近有最大吸收，杂质C 和E 于305 nm 波长附近有最大吸收，参考《美国药典》选择杂质A，B，D+F，E及主峰泮托拉唑钠均于290 nm 波长处检测；杂质C 于290 nm 波长处斜率大，受波长影响较大，故选择杂质C 的检测波长为305 nm［14-16］。该品种使用常见的C18液相色谱柱及2.1 项下色谱条件的流动相梯度系统，检出多个杂质，且系统适用性溶液中各杂质分离度符合要求。建议完善注射用泮托拉唑钠的有关物质质量控制标准，并纳入新版药典。所制订的杂质限度可满足该品种的有关物质质量控制，且杂质D 和杂质F 得到有效分离，杂质D 和杂质F的含量计算较国外药典用杂质D+F 混合物含量计算更合理。