高效液相色谱指纹图谱结合一测多评法评价诃子药材质量

2024-03-18张炜文

中国药业 2024年5期

张炜文，袁静

（江苏省南通卫生高等职业技术学校，江苏南通 226000）

诃子来源于使君子科植物诃子Terminalia chebulaRetz. 或绒毛诃子Terminalia chebulaRetz.var.tomentellaKurt. 的干燥成熟果实，性平，味苦、酸、涩，归肺、大肠经，临床用于治疗久泻久痢、便血脱肛、肺虚喘咳、久嗽不止、咽痛音哑等症。现代研究表明，诃子具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、降糖、护肝等药理学作用［1-3］。诃子药材含多种化学成分，其中主要含鞣质类和酚酸类［4-6］。2020年版《中国药典（一部）》仅收载了诃子药材的鉴别、检查和浸出物含量［7］，为完善诃子的质量控制方法，本研究中建立了不同产地诃子药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，结合指纹图谱的相似度计算及化学计量学分析方法［8-9］，对收集的18 批诃子药材进行综合评价。并采用一测多评法［10］对莽草酸、没食子酸、没食子酸甲酯、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸8 个成分进行测定，利用外标法验证其科学性和可行性，为诃子的质量评价提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

e2695 Waters 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；ABS-135S 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为0.01 mg）；KH-250SPV型台式双频数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

没食子酸对照品（批号为110831-201906，纯度为91.5%），鞣花酸对照品（批号为111959-201903，纯度为88.8%），均购自中国食品药品检定研究院；莽草酸对照品（批号为138 - 59 - 0），诃子酸对照品（批号为18942-26-2），柯里拉京对照品（批号为23094-69-1），没食子酸甲酯对照品（批号为99-24-1），没食子酸乙酯对照品（批号为831-61-8），诃黎勒酸对照品（批号为18942 - 26 - 2），纯度均不低于98.0%，均购自成都德思特生物技术有限公司；诃子药材（编号为S1-S18，样品信息见表1），经江苏省南通卫生高等职业技术学校张志义副教授鉴定为正品；甲醇（分析纯，西陇科技股份有限公司）；磷酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；水为超纯水。

表1 18批诃子药材样品信息Tab.1 Information of 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：迪马Diamonsil Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min 时10%A，10～20 min 时10%A →25%A，20～25 min 时25%A →30%A，25～33 min 时30%A →45%A，33～40 min 时45%A →50%A，40～46 min 时50%A →60%A，46～50 min 时60%A →10%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取莽草酸、没食子酸、没食子酸甲酯、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸对照品各适量，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇超声（功率为250 W，频率为40 kHz）使溶解，制成莽草酸、没食子酸、没食子酸甲酯、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸质量浓度分别为992.8，1 502.0，365.7，1 604.0，205.4，2 988.0，980.4，1 473.0 μg/mL 的混合对照品贮备液；精密量取3 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，即得莽草酸、没食子酸、没食子酸甲酯、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸质量浓度分别为119.1，180.2，43.9，192.5，24.6，358.6，117.6，176.8 μg/ mL 的混合对照品溶液。

供试品溶液：取药材粉末（过3 号筛）0.50 g，精密称定，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率为250 W，频率为40 kHz）40 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：分别精密吸取2.2项下供试品溶液和混合对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定。结果8 个成分与相邻色谱峰间的分离度均大于2.0，理论板数按莽草酸峰、没食子酸峰、没食子酸甲酯峰、柯里拉京峰、没食子酸乙酯峰、诃黎勒酸峰、鞣花酸峰、诃子酸峰计均大于8 900，且8 个成分的对称因子在0.95～1.11之间。色谱图见图1。

2. 莽草酸 7. 没食子酸 11. 没食子酸甲酯 14. 柯里拉京15. 没食子酸乙酯 16. 诃黎勒酸 20. 鞣花酸 22. 诃子酸A. 混合对照品溶液 B. 供试品溶液图1 系统适用性试验高效液相色谱图2.Shikimic acid 7.Gallic acid 11.Methyl gallate 14.Corilagin 15.Ethyl gallate 16.Chebulagic acid 20.Ellagic acid 22.Chebulinic acidA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test

精密度试验：取2.2项下供试品溶液（编号为S1）适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次。结果共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.0%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（编号为S1），按2.2 项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（编号为S1），按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0，2，6，12，18，24 h 时按2.1项下色谱条件进样测定。结果共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.0%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱建立与分析

2.4.1 指纹图谱建立与相似度评价

取18批诃子药材粉末（过3号筛），按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，将18批样品的色谱图CDF格式导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版），以编号为S1的药材样品的色谱图为参照图谱，按中位数法，经多点校正自动匹配生成指纹图谱［11］，结果见图2。对18 批诃子药材进行相似度评价，结果相似度均大于0.95。详见表2。

图2 18批诃子药材的高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.2 HPLC overlay fingerprints of 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus

表2 18批诃子药材的相似度Tab.2 Similarity of 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus

2.4.2 共有峰指认

由图3 可知，18 批药材样品有23 个共有峰，通过与混合对照品溶液HPLC 图（图1 A）比对，指认出2 号峰为莽草酸，7号峰为没食子酸，11号峰为没食子酸甲酯，14号峰为柯里拉京，15号峰为没食子酸乙酯，16号峰为诃黎勒酸，20 号峰为鞣花酸，22 号峰为诃子酸。选择峰形较好，与相邻色谱峰分离完全，峰面积响应值及保留时间适中的14号峰柯里拉京为参照峰（S）。

2. 莽草酸 7. 没食子酸 11. 没食子酸甲酯 14. 柯里拉京15. 没食子酸乙酯 16. 诃黎勒酸 20. 鞣花酸 22. 诃子酸图3 诃子药材共有峰高效液相色谱对照图谱2.Shikimic acid 7.Gallic acid 11.Methyl gallate 14.Corilagin 15.Ethyl gallate 16.Chebulagic acid 20.Ellagic acid 22.Chebulinic acidFig.3 HPLC reference chromatogram of the common peak of Terminaliae Chebulae Fructus

2.4.3 化学计量学分析

聚类分析：采用SPSS 22.0统计学软件分析，以18批诃子药材的23 个共有峰峰面积为变量，采用组间联接法对其进行聚类分析［12］。当判别条件距离为15 时，18 批诃子药材被聚为2 类，其中编号为S17 和S18 的样品聚为一类，其余样品聚为一类。详见图4。

图4 18批诃子药材的系统聚类树状图Fig.4 Dendrogram for the systematic clustering of 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus

主成分分析：以18 批诃子药材的23 个共有峰峰面积为变量进行主成分分析［13-14］，以主成分特征值大于1为依据，提取得到5 个主成分的累积方差贡献率为84.088%，表明这5个主成分能代表23个共有峰在18 批样品中84.088%的信息。详见表3。根据初始因子载荷矩阵及特征值计算特征向量，由此计算5个主成分的得分（F1，F2，F3，F4，F5），以5 个主成分的方差贡献率为权重系数，计算综合得分（F）。F=（47.231% ×F1+13.963% ×F2+ 10.784% ×F3+ 6.906% ×F4+5.204%×F5）/84.088%。结果青海产诃子药材（编号为S17，S18）的综合得分最高，质量较好，不同产地及同一产地不同批次诃子药材质量存在一定差异，表明产地与诃子药材的质量差异有关。详见表4。

表3 主成分特征值与方差分析结果Tab.3 Characteristic values and analysis of variance results of principal components

表4 18批诃子药材样品主成分得分与排名Tab.4 Score and ranking of principal components of 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus

2.5 一测多评法测定诃子药材中8 个成分的含量

2.5.1 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取2.2项下混合对照品贮备液适量，加甲醇依次稀释为不同质量浓度的混合对照品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，以对照品溶液的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、各成分的峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表5。

表5 线性关系考察结果Tab.5 Results of the linear relation test

精密度试验：精密量取2.2 项下混合对照品溶液10 μL，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果莽草酸、没食子酸、没食子酸甲酯、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸峰面积的RSD分别为0.85%，0.96%，1.02%，0.54%，0.71%，0.39%，0.87%，1.22%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号为S1）粉末（过3号筛）适量，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，6，10，16，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果莽草酸、没食子酸、没食子酸甲酯、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸峰面积的RSD分别为0.91%，1.05%，1.24%，0.86%，1.63%，1.47%，0.82%，1.31%（n= 6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取稳定性试验项下供试品溶液6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算诃子药材中上述8 个成分含量及RSD值。结果莽草酸、没食子酸、没食子酸甲酯、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸的平均含量分别为12.33，18.76，4.52，20.15，2.53，37.44，12.25，15.47 mg/ g，RSD分别为0.96%，1.26%，1.38%，1.04%，1.62%，1.81%，0.99%，1.54%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（编号为S1）粉末（过3号筛）0.25 g，精密称定，共6 份，置具塞锥形瓶中，分别加入2.2 项下混合对照品贮备液3.0 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算8个成分的加样回收率。结果莽草酸、没食子酸、没食子酸甲酯、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸的平均加样回收率分别为98.75%，96.98%，97.52%，98.65%，98.22%，97.96%，99.02%，98.36%，RSD分别为1.42%，1.63%，1.02 %，0.89%，1.36%，1.24%，1.66%，1.18%（n=6），表明方法回收率良好。

2.5.2 相对校正因子（RCF）计算

采用多点校正法，以柯里拉京为内参物，计算莽草酸、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸的RCF。取2.5.1项下线性关系考察中的系列浓度对照品溶液的峰面积，按公式计算平均RCF值，作为定量用RCF。fsi=fs/fi=（As×Ci）/（Cs×Ai）。式中，Ai为待测成分峰面积；Ci为待测成分浓度；As为内参物峰面积；Cs为内参物浓度；fsi为RCF［15-16］。结果见表6。

表6 诃子药材中7个成分的相对校正因子Tab.6 Relative correction factors of seven components in Terminaliae Chebulae Fructus

2.5.3 RCF 耐用性考察

精密量取2.2 项下混合对照品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，分别考察不同品牌高效液相色谱仪、不同色谱柱（规格均为250 mm × 4.6 mm，5 μm）和不同柱温对没食子酸、莽草酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸的RCF 的影响。结果的RSD均小于2.0%（n=3），表明不同色谱仪、色谱柱和柱温对没食子酸、莽草酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸的RCF 无显著影响。详见表7和表8。

表7 不同高效液相色谱仪及色谱柱对相对校正因子和相对保留时间的影响（n=3）Tab.7 Effects of different HPLC instruments and chromatographic columns on RCF and RRT（n = 3）

表8 不同柱温对相对校正因子和相对保留时间的影响（n=3）Tab.8 Effect of different column temperatures on RCF and RRT（n = 3）

2.5.4 待测色谱峰定位

根据2.5.3项下耐用性考察结果，以柯里拉京峰为参照峰，计算莽草酸、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸相对于柯里拉京的相对保留时间（RRT）。结果的RSD均小于2.0%（n=3），表明不同仪器、色谱柱和柱温对莽草酸、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸的RRT影响较小，故可以RRT作为色谱峰的定位。详见表7和表8。

2.5.5 一测多评法与外标法含量测定结果比较

取18 批（编号为S1 - S18）诃子药材粉末（过3 号筛）适量，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，分别采用一测多评法和外标法计算18 批诃子药材中8 个成分的含量。采用SPSS 22.0 统计学软件对2 种方法测定结果进行配对t检验，考察一测多评法的准确性。结果莽草酸、没食子酸甲酯、没食子酸、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸一测多评法与外标法含量测定结果无显著差异（P=0.413，0.394，0.438，0.092，0.248，0.559，0.546），表明一测多评法可用于测定诃子药材中8 个成分的含量。详见表9。

表9 18批诃子药材中8个成分含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.9 Results of the content determination of eight components in 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus（mg / g，n = 3）

3 讨论

3.1 色谱条件选择

分别考察4种流动相（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液）的梯度洗脱效果，结果以乙腈- 0.1%磷酸溶液为流动相时，色谱峰峰形较好、色谱峰较多。利用二极管阵列检测器在190～400 nm 波长范围内扫描混合对照品溶液，并参考文献［17-19］，最终选择270 nm作为检测波长。

3.2 提取方法考察

分别考察了不同提取溶剂（不同浓度甲醇和乙醇）、不同提取方法（加热回流和超声）、不同提取时间（20，40，60 min）对提取效果的影响，综合考虑测定结果和可操作性，确定以70%甲醇为提取溶剂，超声提取40 min为提取方法。

3.3 指纹图谱分析

本研究中建立了18 批诃子药材的HPLC 指纹图谱，共确定了23 个共有峰，相似度均大于0.95，表明云南、广东、广西、海南、新疆、青海6个产地的诃子药材质量的一致性较好。其中，编号为S17 和S18 的诃子药材的相似度较其他批次高。聚类分析结果显示，诃子药材可聚为2类，编号为S17和S18的样品聚为一类，其余样品聚为一类，与相似度评价结果一致。主成分分析结果显示，降维生成的5个主成分能代表共有峰84.088%的信息。通过计算18 批诃子药材的综合得分，编号为S17和S18的样品的综合得分最高，分别为1.735，2.290，与相似度分析、聚类分析和主成分分析结果一致，表明产地为青海的诃子药材的质量较好。