基于抗炎活性的香花崖豆藤化学成分研究*

姚采平，邱 飞，2，郭燕华，李燕华，刘建锋，2△

（1. 湖南医药学院第一附属医院，湖南 怀化 418000； 2. 湖南医药学院·侗医药研究湖南省重点实验室，湖南 怀化 418000）

香花崖豆藤Millettia dielsianaHarms 是侗族常用民间药材，又名山鸡血藤、大巴豆、山胡豆，为豆科崖豆藤属植物的藤茎［1］，味苦、微甘，性温，归肝、心、肾经，具有行气、解热、止血、驱风除湿、通经活络功效，常用于治疗偏头痛。研究表明，香花崖豆藤具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗炎、促进造血等药理学作用［2］，但未进行相关抗炎活性的化学成分研究。目前，分离出的化学成分主要有黄酮类、蒽醌类、生物碱类、萜类、甾类、有机酸或酯类、多糖等［3-12］。本研究中评价了香花崖豆藤70%乙醇提取物经聚酰胺柱初分后，不同极性部位对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7 巨噬细胞炎性模型一氧化氮（NO）释放量及环氧合酶2（COX-2）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达水平的影响，并以抗炎活性为导向对有效部位进行系统的化学成分分离，为阐明香花崖豆藤的抗炎机制提供理论依据。

1 仪器、试药与细胞

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪，WondaSilC18柱（150mm×4.6 mm，5 μm），均购于日本Shimadzu 公司；Aston SC5制备柱［（280 mm × 10 mm，5 μm），湖南德米特仪器有限公司］；AV-600 spectrometer 型核磁共振波谱仪（瑞士Bruker 公司）；Ti2 - U 型倒置显微镜（日本Nikon 公司）；5702R 型高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；FORMA STERI-CYCLE i160 型二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；iMark型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；Bio-Rad 1658029型号蛋白电泳仪（伯乐生命医学产品＜上海＞有限公司）；5200Multi型化学发光荧光成像仪（上海天能科技有限公司）。

1.2 试药

香崖豆藤于2017年11月采自湖南省怀化市，经湖南医药学院邓伟峰教授鉴定为正品；聚酰胺（国药集团化学试剂有限公司，批号分别为20151228 ＜30～60 目＞，20180720 ＜100～200 目＞）；Sephadex LH - 20 凝胶色谱（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号为C2012176）；胰蛋白酶（批号为B121103），胎牛血清（批号为M430984），高糖DMEM 培养基（批号为K211005），L- 谷酰胺（货号为S210JV），5 × SDS 蛋白上样缓冲液（批号为20221214），均购于上海源培生物科技股份有限公司；LPS（西格玛奥德里齐＜上海＞贸易有限公司，批号为0000189647）；NO 试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司，货号为S0023）；CCK - 8 试剂（批号为20220928），青-链霉素溶液（货号为C100C5），RIPA 裂解液（批号为20221107），14 - 250KD 蛋白预染marker（货号为P9006），超敏增强型化学发光（ECL）试剂盒（批号为20221115），均购于苏州新赛美生物科技有限公司；兔抗人抗体iNOS 一抗（货号为Ab178954），COX- 2 抗体（货号为Ab17988），均购于英国Abcam 公司；羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（货号为S0001），羊抗小鼠HRP 标记二抗（货号为S0002），均购于Affinity Biosciences；地塞米松（北京索莱宝科技有限公司，货号为ID0170）；Greiss 试剂盒（北京百瑞极生物科技有限公司，货号为BN16025）。

1.3 细胞

RAW264.7 细胞系来自湖南医药学院生物医学研究中心细胞库。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取香花崖豆藤4.5 kg ，加10 倍量70%乙醇，室温冷浸15 d，冷浸液进一步浓缩得浸膏506 g，浸膏用适量甲醇溶解，经聚酰胺（30～60 目）搅拌挥干溶剂，并装于100～200目聚酰胺柱，用水、40%乙醇、70%乙醇、100%乙醇洗脱，回收溶剂后分别得水洗脱部位96 g，40%乙醇洗脱部位123 g，70%乙醇洗脱部位189 g，100%乙醇洗脱部位67 g。

根据抗炎活性筛选结果，对香花崖豆藤40%乙醇洗脱部位进行系统分离，依次经Sephadex LH-20 凝胶色谱及半制备高效液相色谱分离纯化，分别得化合物1（21 mg）和化合物2（35 mg）。

2.2 化合物结构鉴定

化合物1：白色针状结晶，易溶于甲醇，不溶于水。1H - NMR（600 MHz，DMSO -d6）δ：12.23（1H，s，5 -OH），10.81（1H，s，7 - OH），6.89（1H，d，J= 6.0 Hz，H - 5'），6.78（1H，d，J= 6.0 Hz，H - 6'），5.91（2H，s，6 - H，8 - H），4.46（2H，m，H - 2），4.31（1H，m，H -3），3.79（3H，s，4' - OCH3），3.74（3H，s，2' - OCH3），3.73（3H，s，3' - OCH3）。13C - NMR（600 MHz，DMSO -d6）δ：70.5（C - 2），46.9（C - 3），197.5（C - 4），167.0（C - 5），96.5（C - 6），164.4（C - 7），95.3（C - 8），163.5（C - 9），153.8（C - 10），121.2（C - 1'），153.8（C - 2'），151.9（C - 3'），142.2（C - 4'），108.3（C -5'），125.2（C - 6'），61.0（2' - OCH3），60.7（3' -OCH3），56.4（4'-OCH3）。以上波谱数据与文献［13］的报道结果基本一致，经鉴定，化合物1 为5，7 - dihydroxy-2'，3'，4'-trimethoxyisoflavanone（C18H18O7）。

化合物2：淡黄色针状结晶，易溶于甲醇，不溶于水。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.96（1H，s，5-OH），10.88（1H，s，7-OH），9.58（1H，s，4'-OH），8.33（1H，s，H - 2），7.39（2H，dd，J= 6.0 Hz，H - 3'，H -5'），6.82（2H，dd，J=6.0 Hz，H-2'，H-6'），6.39（1H，d，J= 6.0 Hz，H - 6），6.22（1H，d，J= 6.0 Hz，H - 8）。13C - NMR（600 MHz，DMSO -d6）δ：154.5（C - 2），122.7（C - 3），180.7（C - 4），162.5（C - 5），99.4（C -6），164.8（C-7），94.1（C-8），158.1（C-9），104.9（C-10），121.7（C-1'），115.5（C-2'，C-6'），130.6（C-3'，C-5'），157.9（C-4'）。以上波谱数据与文献［14］的报道结果基本一致，经鉴定，化合物2 为5，7，4' - trihydroxyisoflavanone（C15H10O5）。

2.3 抗炎活性评价

2.3.1 细胞培养

RAW264.7细胞在含10%低内毒素胎牛血清、青霉素G（10 000 U/ mL）、链霉素（10 μg/ mL）、L- 谷酰胺（29.2 mg/ mL）的DMEM 培养基中，置37 ℃、5%CO2培养箱中传代培养，收集对数生长期细胞。

2.3.2 CCK-8 法检测细胞活力

取对数生长期的RAW264.7 细胞，用培养基制成2×106个/mL的单细胞悬液，接种于96孔板，置培养箱中培养24 h。试验分为水洗脱部位组（A 组）、40%乙醇洗脱部位组（B 组）、70%乙醇洗脱部位组（C 组）、100%乙醇洗脱部位组（D 组）、阳性对照组和空白组，每组各6 个复孔。吸弃各孔培养液，A 组、B 组、C 组、D 组每孔加质量浓度为50 μg/mL 的供试药液，阳性对照组加浓度为0.5 μmol/ L 的地塞米松，空白组加培养基。置培养箱中继续培养24 h后，上述各组各孔分别加10 μL质量浓度为5 mg/mL 的CCK-8溶液，30 min后利用酶标仪于570 nm 波长处测定吸光度值，计算细胞存活率，试验重复3 次。结果在50 μg / mL 质量浓度作用24 h 后，A 组、B 组、C 组、D 组细胞存活率均在80%以上，但组间无显著差异（P＞0.05）。详见图1。

图1 不同极性部位作用下RAW264.7细胞的存活率Fig.1 Viability of RAW264.7 cells under different polar parts

2.3.3 Griess 法检测细胞产生NO 含量

试验分为A 组、B 组、C 组、D 组、阳性对照组、模型组和空白组。取对数生长期的RAW264.7 细胞，用培养基制成2 × 106个/ mL 的单细胞悬液，接种于96 孔板，置培养箱中培养24 h。24 h 后吸弃上清液，A 组、B 组、C组、D组分别加入待测物溶液（质量浓度为50 μg/mL），阳性对照组加入地塞米松（浓度为0.5 μmol/L），模型组和空白组加入等量完全培养液。2 h 后，A 组、B 组、C组、D组、阳性对照组加入LPS（质量浓度为10 μg/mL）继续培养，模型组加入LPS（质量浓度为10 μg/mL）刺激24 h，空白组加入等量完全培养液。24 h 后，取50 μL培养基上清液，加入Greiss1试剂，室温避光振摇10 min，再加入Greiss2 试剂，室温避光振摇10 min，以完全培养基加显色剂作为空白对照，利用酶标仪于540 nm波长处测定各孔的吸光度值。结果与模型组比较，A组NO释放量增多，B组、C组、D组NO释放量均显著减少（P＜0.001），且B 组减少最多，故以40%乙醇洗脱部位进行系统分离。详见图2。

图2 不同极性部位对RAW264.7细胞产生NO的影响Note：Compared with those in the model group，*P ＜0.01，**P ＜0.001（for Fig.2 - 3）.Fig.2 Effect of different polar parts on NO production in RAW264.7 cells

2.3.4 免疫印迹（Western blot）法检测iNOS 和COX-2蛋白表达

取对数生长期的RAW264.7 细胞，用培养基制成5×105个/mL的单细胞悬液，接种于12孔板，置培养箱中培养24 h。试验分组及给药同2.3.3 项下。24 h 后，提取细胞总蛋白，采用Western blot法检测iNOS和COX-2的蛋白表达水平。结果与模型组比较，A 组、B 组、D 组COX - 2 蛋白表达下调；B 组iNOS 蛋白表达显著下调（P＜0.01），故以40%乙醇洗脱部位进行系统分离。详见图3。

图3 不同极性部位对RAW264.7细胞COX-2和iNOS蛋白表达水平的影响A.COX - 2 B.iNOSFig.3 Effect of different polar parts on the expression of COX - 2 and iNOS protein in RAW264.7 cells

3 讨论

本研究中以LPS 诱导的RAW264.7 巨噬细胞炎性模型评价了侗药香花崖豆藤不同极性部位对COX - 2和iNOS 蛋白表达水平的影响。结果表明，其40%乙醇洗脱部位能显著降低NO 的释放量，并能选择性地抑制iNOS 蛋白的表达，提示40%乙醇洗脱部位可能为香花崖豆藤发挥抗炎活性的有效部位。采用凝胶柱色谱及半制备高效液相色谱对其进行系统分离，得到2个化合物，并经NMR 结合文献波谱数据比对确认为5，7 - dihydroxy-2'，3'，4'-trimethoxyisoflavanone（化合物1）和5，7，4'-trihydroxyisoflavanone（化合物2），其中化合物1为首次从香花崖豆藤中分离得到。

文献［13］报道，化合物1 对LPS 诱导RAW264.7 细胞的NO 生成具有较强的抑制活性，半数有效抑制浓度（IC50）低于50 μmol/ L，而化合物2 对LPS 诱导RAW264.7细胞的COX-2表达有显著抑制作用［15］。提示化合物1 和化合物2 可能为香花崖豆藤发挥抗炎活性的药效物质基础，并可能通过调控COX - 2 和iNOS蛋白的表达而发挥抗炎作用。

香花崖豆藤为治疗偏头痛的侗族常用民间药材，应用历史悠久。研究表明，偏头痛患者NO 水平增加引起的氧化应激性损伤是引起偏头痛的重要原因［16-18］。抑制一氧化氮合酶（NOS）对偏头痛的急性或预防性治疗提供了可行途径。本研究中初步探讨了香花崖豆藤40%乙醇洗脱部位通过选择性抑制iNOS 蛋白的表达，以发挥治疗偏头痛作用的部分药效物质基础，可为其治疗偏头痛的药理作用研究及后续开发提供参考。