喜树果黄酮绿色提取工艺的响应面法优化

张欣欣,范圆圆,原甜梦,刘雨露,肖 莉

(湖州师范学院 生命科学学院,浙江 湖州 313000)

0 引 言

喜树果(FructusCamptothecaeAcuminatae)为药用植物喜树的果实,含喜树碱类、黄酮类、鞣花酸类等成分,具有抗癌、散结、破血化瘀等功效[1].目前,对于喜树果的研究主要集中于喜树碱类抗癌成分[2],而对于黄酮类成分的研究鲜有报道.黄酮化合物具有抗氧化、抗心脑血管疾病、延缓衰老等多种生理功能,因此具有较高的临床应用价值.由于黄酮类成分水溶性较差,传统提取方法大多采用乙醇、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂[3].但传统提取方法存在成本高、环境污染大,以及提取物有机溶剂残留超标等缺陷.因此,寻找高效环保的绿色溶剂成为当务之急.

低共熔溶剂(DES)是由氢键供体与氢键受体合成的混合溶剂,在特定比例下二者之间会产生较强的分子间氢键作用,对一些难溶性物质有特殊的溶解性能,具有绿色、环保、提取效果优良等有机溶剂无法比拟的优点,目前已被广泛应用于中药材的提取和分离方面,具有较好的市场应用前景[4-6].

本研究以喜树果总黄酮(FructusCamptothecaeAcuminataeflavonoids,FCAFs)提取率为指标,采用超声波辅助DSE溶剂法和Box-Behnken响应面设计方法建立模型,从而得到最优的提取工艺,实现FCAFs的绿色高效提取,以更好地促进喜树果的深度开发.

1 实 验

1.1 材料与仪器

喜树果,购自慕韩斋药店,过40目筛粉碎备用;芦丁标准品、氯化胆碱、葡萄糖、乙二醇、乳酸、1,2-丙二醇、甲醇、乙醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、丙二酸、柠檬酸、苹果酸、尿素,均为分析纯,购自上海麦克林生化科技有限公司.

ES-600型电子分析天平(湖南湘平科技公司)、KQ2200DE型超声清洗器(武汉集思仪器设备公司)、UV2600紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)、GL-20G-Ⅱ高速离心机(赛默飞世尔科技有限公司)、HHS数显水浴锅(河南长征科贸公司).

1.2 实验方法

1.2.1 总黄酮提取率的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定FCAFs含量[7],得到标准曲线方程：Y=0.008 3X+0.014 1,R2=0.999 9.当总黄酮浓度在0.005～0.035 mg/mL 范围内时,其线性关系良好.

按式(1)计算FCAFs提取率：

(1)

其中,W为FCAFs提取率(%),X为提取液中FCAFs质量浓度(mg/mL),V为提取液体积(mL),M为喜树果粉末质量(g).

1.2.2 DES的合成

以氯化胆碱为氢键受体,选择乙二醇、乳酸、1,2丙二醇、甲醇、乙醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、柠檬酸、苹果酸、丙二酸、尿素、葡萄糖12种物质为氢键供体,制备12种DES溶剂,分别为：氯化胆碱∶乙二醇摩尔比为1∶4(组1);氯化胆碱∶乳酸(摩尔比)为1∶1(组2);氯化胆碱∶1,2-丙二醇(摩尔比)为1∶1(组3);氯化胆碱∶甲醇(摩尔比)为1∶1(组4);氯化胆碱∶乙醇(摩尔比)为1∶1.5(组5);氯化胆碱∶1,3-丁二醇(摩尔比)为1∶3(组6);氯化胆碱∶1,4-丁二醇(摩尔比)为1∶3(组7);氯化胆碱∶柠檬酸(摩尔比)为1∶1.5(组8);氯化胆碱∶苹果酸(摩尔比)为1∶3(组9);氯化胆碱∶丙二酸(摩尔比)为1∶3(组10);氯化胆碱∶尿素(摩尔比)为1∶1(组11);氯化胆碱∶葡萄糖(摩尔比)为1∶3(组12).将上述12种DES溶剂的含水量均控制在20%,在加热条件下磁力搅拌直至形成均相溶液,冷却至室温备用.

1.2.3 FCAFs的提取

精密称取12份0.5 g喜树果粉末,按照一定液料比分别加入到1.2.2中合成的12种DES溶剂中,40 ℃超声(200 W,35 kHz)提取60 min,提取液离心15 min(5 000 r/min),取上清液并按1.2.1中的方法计算FCAFs提取率.

1.2.4 单因素试验

以FCAFs提取率为指标,选择5个因素进行单因素考察,分别为：加水量(水平设置为0%、20%、40%、60%、80%)、DES(氯化胆碱∶柠檬酸)摩尔比(水平设置为2∶1、2∶2、2∶3、2∶4、2∶5)、液料比(水平设置为30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1)(mL/g)、提取温度(水平设置为20、30、40、50、60 ℃)、提取时间(水平设置为20、30、40、50、60 min).

1.2.5 响应面优化试验

参考单因素试验结论,选择对黄酮提取效果影响较大的3个因素,即液料比、提取时间、提取温度为自变量,FCAFs(R1)为响应值,利用 Box-Behnken响应面优化法设计3因素3水平优化试验.具体因素与水平见表1.

表1 响应面因素水平表

2 结果与分析

2.1 DES溶剂筛选

图1为DES 溶剂的筛选情况.由图1可知,第8组的FCAFs提取率最高,为2.85%,故选择氯化胆碱与柠檬酸合成的DES溶剂为提取溶剂.

图1 DES 溶剂的筛选

2.2 单因素试验

2.2.1 DES摩尔比对FCAFs提取率的影响

图2为DES摩尔比对FCAFs提取率的影响.由图2可知,当氯化胆碱∶柠檬酸的摩尔比从1∶0.5到1∶2.5变化时,FCAFs提取率呈先升后降的趋势.其主要原因是氯化胆碱的极性较低,柠檬酸的极性较高,当它们的摩尔比达到1∶1.5时,最适极性刚好形成,此时FCAFs提取率最高,达2.85%.

图2 DES摩尔比对FCAFs提取率的影响

2.2.2 含水量对FCAFs提取率的影响

图3为含水量对FCAFs提取率的影响.由图3可知,FCAFs提取率随DES体系含水量的提高而升高,当含水量为20%时,达到最高值2.48%.其原因可能是初期水的加入降低了溶剂体系的粘度,有助于提高喜树果药材中细胞破壁的能力,从而提升黄酮的溶出率.但当体系含水量进一步提高时,在体系粘度降低的同时溶剂极性增加,使分子间的氢键和超分子结构遭到破坏,进而使FCAFs提取率下降[8].

图3 含水量对FCAFs提取率的影响

2.2.3 液料比对FCAFs提取率的影响

图4为液料比对总黄酮提取率的影响.由图4可知,FCAFs提取率随液料比的增大而升高,当液料比达到60∶1 时,FCAFs提取率达到峰值2.89%.其原因可能是初期液料比的增大有利于喜树果药材细胞破壁,使黄酮溶出率增大.但液料比的进一步增加可能会引起黄酮溶解出现过饱和,进而使FCAFs提取率下降.

图4 液料比对FCAFs提取率的影响

2.2.4 超声温度对FCAFs提取率的影响

图5为温度对FCAFs提取率的影响.由图5可知,在50 ℃前,FCAFs提取率随超声温度的升高而升高,但继续升高温度,总黄酮提取率下降.其原因可能是升温导致DES体系的黏度下降,增加了喜树果粉末的分散性,加速了溶质的传质作用,有利于有效成分的析出.但当体系温度进一步升高时,黄酮类化合物会发生降解反应,导致FCAFs提取率下降[9].

图5 温度对FCAFs提取率的影响

2.2.5 提取时间对FCAFs提取率的影响

图6为提取时间对FCAFs提取率的影响.由图6可知,FCAFs提取率随提取时间的延长而升高,50 min时达到峰值3.18%,随后提取率开始下降.其原因可能是随着提取时间的延长,超声波引起的空化效应逐步增强,导致对喜树果细胞壁的破坏力度加大,FCAFs提取率提高.但超声时间的延长也会引起体系温度上升、超声辐射和热效应作用增强,以及黄酮类成分的降解,从而使FCAFs提取率下降.

图6 提取时间对FCAFs提取率的影响

2.3 响应面试验结果与优化

基于单因素试验结果,选择液料比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)3个因素为自变量,以FCAFs提取率为响应值(R1),按照Box-Behnken优化法设计17组实验.实验设计及结果见表2.

表2 Box-Behnken 实验设计及结果

以FCAFs的提取率为指标(R1),采用Design-expert软件进行线性回归拟合,得到回归方程：R1=3.27-0.033A+0.070B+0.005C-0.015AB-0.045AC-0.005BC-0.17A2-0.27B2-0.26C2.回归模型方差分析见表3.

表3 回归模型方差分析

图7 两因素交互作用对FCAFs提取率影响的响应面图

2.4 最优方案验证

通过Design-Expert软件分析得到FCAFs的最优提取工艺为：含水量为20%、液料比为60.9∶1(g/mL)、50 ℃提取1次、提取时间为51.3 min.结合实际的实验条件及操作的可行性,修正的最优方案为：含水量为20%、液料比为61∶1(g/mL)、50 ℃超声提取1次、提取时间为51 min.修正的最优方案的FCAFs提取率理论值为3.28%.按此工艺进行3次平行实验,FCAFs平均提取率为3.29%,接近理论值,说明该优化工艺稳定可靠.

3 结 论

本文采用超声波辅助DES溶剂法,建立并优化了一种绿色高效的喜树果黄酮提取工艺.以FCAFs提取率为指标,通过单因素试验考察DES溶剂组成(氯化胆碱与柠檬酸的摩尔比、含水量)、液料比、提取时间、提取温度等因素对FCAFs提取率的影响,并在此基础上结合Box-Behnken响应面法分析得到最优的提取工艺：氯化胆碱与柠檬酸的摩尔比为 1∶1.5、加水量为20%、液料比为61∶1(g/mL)、50 ℃超声1次、超声时间为51 min.在此条件下,FCAFs提取率约为3.29%,是文献报道的有机溶剂提取率[10]的3倍.本研究为喜树果的开发利用提供了参考,也为中药材活性成分的绿色提取提供了一定的借鉴.